规格 磁珠法外泌体RNA提取试剂盒 G3624-50T 50T 产品简介 本试剂盒基于超顺磁性磁珠对核酸的可逆吸附作用被设计用于从100 µL-1 mL的血清/血浆、500 µL-4 mL细胞培养上清、500 µL-4 mL尿液等无细胞样本纯化的外泌体中分离RNA，包括非编码RNA、mRNA、miRNA以及其他小RNA。纯化外泌体时，必须事先通过过滤或离心去除样品中残留的细胞、细胞碎片和凋亡小体。本试剂盒无需苯酚、氯仿等有机试剂。分离得到的产物可用于RT-qPCR、微阵列分析和RNA-seq等下游相关实验。 储存与运输 DNase，DTT Solution冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其余试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。 组成 Component Number Component G 3624 - 50 T G3624-1 Buffer MEL 45 mL G3624-2 Buffer RW1 12 mL G3624-3 Buffer RW2 21 mL G3624-4 SweMag Beads 1 mL G3624-5 DTT Solution 900 µL×2 G3624-6 DNase 500 μL G3624-7 10×DNase Buffer 1 mL G3624-8 Nuclease-free Water 10 mL 说明书 1份 使用前须知（请仔细阅读） 1. Buffer MEL如有沉淀现象，请于37℃加热溶解，待恢复至室温后使用。 2. 操作前请向Buffer MEL加入DTT Solution，至终浓度为4%，即1 mL Buffer MEL加入40 µL DTT Solution。此裂解液最好现配现用，加入DTT Solution的Buffer MEL可在4℃放置一个月。 3. 使用前请向Buffer RW1中加入22 mL无水乙醇，混匀后使用。 4. 使用前请向Buffer RW2中加入84 mL无水乙醇，混匀后使用。 5. 按照提取样本量提前配制60%异丙醇（现配现用）。 6. 自备磁力架。 操作步骤 纯化小片段外泌体RNA： 1. 用1×PBS（pH 7.4）重悬外泌体颗粒，至总体积为200 µL； 2. 向离心管中加入800 μL Buffer MEL （使用前请确认已加入DTT Solution） ，涡旋振荡混匀，室温孵育10 min； 3. 将步骤2混合液转移至5 mL或15 mL Nuclease-free 离心管中； 4. 向离心管中加入2.25倍体积无水乙醇 （ 即200 μL 外泌体样品加入2.25 mL无水乙醇 ） ，使用移液器吹打或涡旋振荡混匀，再加入20 μL SweMag Beads （SweMag Beads使用前需充分振荡至分散均匀） ，使用移液器吹打或涡旋振荡混匀； 5. 室温静置10 min，期间使用移液器或涡旋仪混匀2-3次，使磁珠处于悬浮状态； 6. 将1.5 mL Nuclease-free 空离心管固定到磁力架上，用移液器将步骤5溶液转移到固定在磁力架上的空离心管中，待上清清澈后，吸弃上清，请按同样方法将混合液分多次磁吸，直至所有的混合液磁吸完毕； 7. 加入500 μL Buffer RW1 （ 使用前请确认已加入 无水乙醇） ，移开磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清； 8. 加入 6 00 μL Buffer RW2 （ 使用前请确认已加入 无水乙醇） ，移开磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均匀，将 离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清； 9. 移去磁力架，进行DNase消化： a）DNase工作液配制：取10 μL 10×DNase Buffer，10 μL DNase，80 μL Nuclease-free Water于新的1.5 mL Nuclease-free离心管中混匀； b）向有磁珠的离心管中加入100 μL DNase工作液，使用移液器轻轻吹打至磁珠分散均匀，室温放置15 min，期间每5 min使用移液器混匀一次； 10. 消化结束后加入600 μL Buffer RW2 （ 使用前请确认已加入 无水乙醇） ，使用移液器吹打或涡旋振荡至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清； 11. 重复步骤10； 12. 将离心管盖打开，室温放置5-10 min，使乙醇完全挥发 （避免磁珠过度干燥，以免影响核酸得率） ； 13. 移去磁力架，向离心管中加入30-50 μL Nuclease-free Water，使用移液器轻轻吹打至磁珠分散均匀，室温静置5 min （ 如果管壁残留较多磁珠，可将离心管瞬时离心，收集管壁磁珠于管底） ； 14. 将离心管置于磁力架上，直至磁珠完全吸附，吸取上清至一新的1.5 mL Nuclease-free 离心管中，即得高纯度的外泌体RNA。 纯化大片段外泌体RNA： 1. 用1×PBS（pH 7.4）重悬外泌体颗粒，至总体积为200 µL，将重悬的外泌体颗粒转移至2 mL Nuclease-free 离心管中 （方便后续试剂加入） ； 2. 向离心管中加入800 μL Buffer MEL （使用前请确认已加入DTT Solution） ，涡旋振荡混匀，室温孵育10 min； 3. 向离心管中加入0.66倍体积60%异丙醇 （ 即200 μL 外泌体样品加入660 μL 60%异丙醇 ） ，使用移液器吹打或涡旋振荡混匀，再加入20 μL SweMag Beads （SweMag Beads使用前需充分振荡至分散均匀） ，使用移液器吹打或涡旋振荡混匀； 4. 室温静置10 min，期间使用移液器或涡旋仪混匀2-3次，使磁珠处于悬浮状态； 5. 将离心管移至磁力架上静置30 s，直至磁珠完全吸附，将离心管随磁力架温和地上下颠倒数次，使管壁残留的磁珠冲刷下来，待上清清澈后，吸弃上清； 6. 加入500 μL Buffer RW1 （ 使用前请确认已加入 无水乙醇） ，移开磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清； 7. 加入600 μL Buffer RW2 （ 使用前请确认已加入 无水乙醇） ，移开磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清； 8. 移去磁力架，进行DNase消化： a）DNase工作液配制：取10 μL 10×DNase Buffer，10 μL DNase，80 μL Nuclease-free Water于新的1.5 mL Nuclease-free离心管中混匀； b）向有磁珠的离心管中加入100 μL DNase工作液，使用移液器轻轻吹打至磁珠分散均匀，室温放置15 min，期间每5 min使用移液器混匀一次； 9. 消化结束后加入600 μL Buffer RW2 （ 使用前请确认已加入 无水乙醇） ，使用移液器吹打或涡旋振荡至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清；...