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实验步骤

实验原理

琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定、纯化DNA片段的方法。琼脂糖是一种多糖不带电荷,而DNA带负电荷,在电场的作用下,可以通过凝胶介质从负极向正极移动。不同分子大小的DNA片段和不同构型的分子片段,电泳迁移率不同,因此可以达到分离的目的。核酸染料(例如EB、GoldView、GelRed等)通过和DNA中的核苷酸结合,使得DNA分子在紫外线下发出荧光,就可以观察得到我们需要的目的基因。

 

凝胶配制操作步骤

  1. 配制适量的制胶及电泳缓冲液(常用0.5 x TBE或1 x TAE缓冲液,推荐G3001-500MLG3002-250ML);

  2. 根据制胶量及凝胶浓度,将准确称量的琼脂糖粉末加入含有一定量的电泳缓冲液玻璃三角锥形瓶中(加入电泳缓冲液体积不宜超过锥形瓶50%的容量);

  3. 使用保鲜膜或PE手套套在锥形瓶口上,然后在微波炉中加热溶解琼脂糖;

  4. 待溶液冷却至50℃左右时,可加入一定比例的核酸染料(推荐G3606-100UL)后并充分混匀;

  5. 将琼脂糖溶液倒入制胶槽中,选择合适梳子并插入对应位置,凝胶厚度一般控制在3 ~ 5mm之间,如后续实验需要选择切胶回收胶条中的核酸,可适当增加凝胶厚度,如凝胶中有气泡需将其赶出。

  6. 在室温下30 min左右凝胶即可凝固(不同浓度凝胶凝固时间不同,根据实际情况调整),拔出梳子后凝胶置于电泳槽中电泳使用,电泳缓冲液宜没过凝胶中的加样孔。

加样

将制作好的凝胶和凝胶托盘一起从制胶器中取出,放置于电泳盒中,加样孔靠近负极(黑色为负极)。 添加电泳缓冲液直至没过胶板为止。

用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染。加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面(注意加样的顺序)。

电泳

按照正负极的正确位置盖好上盖(红色为正极,黑色为负极)将电泳导线按正确颜色插入电泳电源, 选择合适的电压开始电泳(具体电泳参数根据实际实验参数调整)。

样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳。

观察

本款一体式水平电泳仪配备了蓝光照胶仪,配合(SPW-6S款电泳电源)可实时观察电泳情况。

一体式水平电泳仪-SVL-2-2.jpg


常见问题

在琼脂糖凝胶电泳中,影响DNA分子迁移率的主要因素有哪些?

(1)DNA分子大小:线性双链DNA分子,在不同浓度凝胶的电泳迁移率与DNA分子的质量成反比,即DNA分子越大,受阻力越大,在凝脂中迁移越慢。

(2)琼脂糖凝胶的浓度:分离不同DNA分子片段的凝胶浓度也有所不同。

常用的琼脂糖凝胶浓度是1%

琼脂糖浓度越高,小分子分辨率越高;琼脂糖浓度越低,大分子分辨率越高。

琼脂糖浓度 最佳线形DNA分辨范围(bp)
0.5% 1000-30000
0.7% 800-12000
1% 500-10000
1.2% 400-7000
1.5% 200-3000
2% 50-2000


(3)DNA分子构象:DNA分子片段常分为线性(Ic)、开环(oc)、超螺旋(sc)结构,在分子量相同的情况下,超螺旋结构迁移率最快,开环的DNA片段移动的最慢。


image.png


(4)电源电压:随着电场强度的增加,DNA分子的迁移率越大。


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