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实验步骤

不同样本类型(植物组织、多糖多酚植物、动物组织、细胞、血液、病毒、细菌、石蜡包埋组织、外泌体、血清、血浆),依据核酸提取试剂盒说明书进行相应操作。

简要流程图:


image.png


此处以G3604-50T 磁珠法组织/细胞/血液基因组DNA提取试剂盒为例:

试剂盒组成

Component Number

Component

G3604-50T

G3604-1

Buffer GA

12 mL

G3604-2

Proteinase K

1 mL

G3604-3

RNase A

200 µL

G3604-4

Buffer GB

12 mL

G3604-5

SweMag Beads

1 mL

G3604-6

Buffer PD

12 mL(使用前加入18 mL无水乙醇)

G3604-7

Buffer PW

24 mL(使用前加入56 mL无水乙醇)

G3604-8

Buffer TE

10 mL

说明书

1份

使用前准备

1. 自备磁力架、无水乙醇。

2. Buffer GA如有沉淀现象,请于65℃加热溶解,待恢复至室温后使用。

3. 使用前请向Buffer PD加入18 mL无水乙醇,向Buffer PW中加入56 mL无水乙醇。


实验步骤

1. 样本处理:

a. 取新鲜或超低温冻存的动物组织2-30 mg,置于装有2-3颗3 mm研磨珠(推荐G0203-150G)的1.5 mL离心管或专用研磨管中,加入200 μL Buffer GA,使用组织研磨仪(推荐KZ-5F-3D)在常温条件下将组织彻底研磨至匀浆状(如果组织没有被彻底匀浆,将会影响DNA的得率和质量);

b. 取106-107细胞悬液,置于1.5 mL离心管中,1,000 rpm离心5 min,使用移液器轻轻吸弃上清。向离心管中加入200 μL Buffer GA,使用涡旋振荡器涡旋混匀;

c. 取50-100 μL无核红细胞全血(含抗凝剂)于1.5 mL离心管中,补加Buffer GA至200 μL,使用涡旋振荡器涡旋混匀(如果处理更大体积的血液,在样本中加入3倍体积红细胞裂解液(推荐G2015)颠倒混匀,室温放置5 min,期间颠倒混匀2-3次,3000 rpm离心10 min,使用移液器轻轻吸弃上清,请勿吸取白细胞沉淀,加入200 μL Buffer GA,使用使用移液器吹打混匀);

d. 取5-20 μL有核红细胞全血(含抗凝剂),置于1.5 mL离心管中,补加Buffer GA至200 μL,使用使用移液器吹打混匀;

2. 加入20 μL Proteinase K和4 μL RNase A,56℃孵育30 min(每10 min混匀一次,可加速组织裂解),较难裂解的材料可以适当延长裂解时间;

3. 1,2000 rpm离心2 min,将组织上清液转移至Nuclease-free离心管中,尽量避免吸取沉淀(提取细胞/血液样本基因组时,请忽略此步骤);

4. 向离心管中加入200 μL Buffer GB,颠倒混匀,70℃放置10 min;

5. 向离心管中加入200 μL无水乙醇,颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀,12,000 rpm离心2 min,将上清液转移至Nuclease-free离心管中,尽量避免吸取沉淀;

6. 向装有上清液的离心管中加入20 μL SweMag Beads(SweMag Beads使用前需充分振荡至分散均匀),使用移液器吹打至磁珠分散均匀;

7. 室温静置10 min,放置过程中,使用移液器吹打混匀2-3次,保持磁珠处于悬浮状态;

8. 将离心管移至磁力架上静置30 s,待上清清澈后,吸弃上清;

9. 加入500 μL Buffer PD,移开磁力架,使用移液器吹打至磁珠分散均匀,将离心管移至磁力架上静置30 s,待上清清澈后,吸弃上清;

10. 加入600 μL Buffer PW,移开磁力架,使用移液器吹打至磁珠分散均匀,将离心管移至磁力架上静置30 s,待上清清澈后,吸弃上清;

11. 重复步骤10;

12. 将离心管盖打开,室温放置5-10 min,使乙醇完全挥发(避免磁珠过度干燥,以免影响核酸得率);

13. 移去磁力架,向离心管中加入50-100 μL Buffer TE或Nuclease-free Water,使用移液器轻轻吹打至磁珠分散均匀,室温静置5 min;

14. 将离心管置于磁力架上,直至磁珠完全吸附,吸取上清至一新的Nuclease-free 1.5 mL离心管中,即得高纯度的DNA。


注意事项

1. 操作之前,请务必认真阅读本产品说明书。

2. 应尽量使用新鲜的实验材料,以确保提取的基因组DNA不被降解。

3. 样品应避免反复冻融,否则会导致提取的DNA产量下降。

4. 组织材料切勿超过最大起始量,且要充分裂解,否则可能影响得率。

5. 磁珠悬液在保存过程中应避免冷冻;磁珠易沉降,使用前应充分振荡使其保持均匀悬浮状态。

6. 向样本中加入磁珠前,需要将样本中的试剂混合均匀。

7. 请勿长时间干燥磁珠,以免影响DNA洗脱效率。


附操作流程简图






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