免疫组化

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。

1、取材时要选择足够锋利的刀片，用镊子夹取样本时，需要尽量小心，避免挤压样本

注意：如果一只动物同时取多种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官（脑，脊髓等），皮肤、肌肉等可放到最后取

2、取材后，要将样本迅速放入固定液中，一般固定液是组织体积的20倍及以上，需确保组织充分固定

3、对于细胞样本，固定后（可选通用性组织固定液G1101-500ML进行固定）需要对细胞进行通透处理，能使细胞膜上产生小孔以利于染料或抗体进入细胞。

注意：

1、取样后尽量保证样本离体后5 min内放入到合适的固定液内，推荐可以使用单支装通用型组织固定液（G1101），单支装即开即用，避免分装。

2. 固定运输过程中，需要选择合适的固定容器，要保证组织在容器内不贴壁，挤压（标准：可轻晃标本瓶，看组织在容器内是否能自由移动）

石蜡切片和冰冻切片都适用于大部分实验，针对常规染色，组化或是荧光优先推荐选择石蜡切片，因为石蜡切片对组织的形态保存比冰冻切片好，并且对抗原基本无影响

注意：如果标本已经放在-80℃冰箱冷冻了之后又想要做石蜡切片，将标本取出来千万不要解冻，直接放于固定液内固定(在固定液内边解冻边固定)。

脱蜡水化可以确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应

注意事项：

1.脱蜡液一定要完全浸没组织切片，为保证脱蜡质量，可以分两步进行，确保完全脱蜡

2.环保型透明脱蜡液冬天温度较低可能会影响脱蜡效果，可以加热到37℃进行脱蜡

组织中部分抗原在固定过程中会发生蛋白之间交联封闭作用，从而失去抗原性，通过抗原修复，将抗原重新暴露，更利于抗原抗体的结合，整强特异性染色

注意事项：

1. 抗原修复方法有很多种，根据组织类型特点可以选择不同的方法，有些适合热修复，有些适合酶解修复。

2. 应用热修复时，需要注意修复液的pH，常用柠檬酸，pH 6.0和EDTA pH 8.0；抗原修复强度：EDTA pH9.0＞EDTA pH8.0＞柠檬酸

用免疫组化笔在载玻片上组织周围画圈，可提供一个薄膜状的疏水性屏障，在不影响实验结果的前提下可有效减少试剂的使用量，并能避免组织表面试剂流失造成的干片情况。

组织内部可能会自带一些酶，如过氧化物酶，这些酶在后续的显色反应中可能会与显色液（如DAB）发生反应，生成颜色沉淀，从而产生假阳性结果。

通过阻断这些内源性酶，可以确保最终生成的颜色沉淀是由目标抗原与抗体结合所产生的，从而提高结果的准确性。

一般选择3%双氧水，室温孵育25min，孵育后需要用PBS等缓冲液洗涤切片，以去除多余的阻断剂

封闭剂能够封闭组织切片上的非特异性结合位点，从而避免抗体与这些非特异性位点的结合。这有助于减少假阳性结果的出现。

封闭剂一般推荐使用二抗同种属来源的动物血清，例如山羊血清，兔血清，驴血清以及牛血清白蛋白(BSA)等。

注意事项：

1.血清孵育完成后不需要进行清洗，轻轻甩掉多余血清即可滴加一抗

2.孵育时可使用免疫组化笔先在组织周围画圈，避免液体流失导致干片

注意事项：

1.二抗的选择可以根据一抗来源进行选择：例如一抗来源是小鼠来源，可以选择山羊抗小鼠二抗；如果一抗来源是兔来源，可以选择抗兔二抗

2.对于信号比较弱的样本，可以选择免疫组化多聚二抗（G1301-10ML），具有信号放大效果，即用型二抗，使用更方便

常用DAB显色，DAB显色为棕色，不溶于有机溶剂，复染后可以分化脱水透明，可以长时间保存

注意事项：

1. DAB工作液配制需现配现用，限当天使用。

2.滴加DAB工作液，显微镜下观察，出现棕黄色阳性时，用PBS或蒸馏水洗涤2次，终止显色

复染能更好的对目标蛋白进行定位

将切片依次放入75%酒精5min--85%酒精5min --无水乙醇Ⅰ 5min --无水乙醇Ⅱ 5min--正丁醇5min--二甲苯Ⅰ 5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，封片胶封片。

注意事项：

1. 甘油明胶封片剂在温度较低时呈固态，使用前需经37-50℃预热至完全溶解。

2. 使用时注意避免产生气泡，滴加到载玻片上时小心操作，加盖玻片时倾斜缓慢放下，防止气泡产生影响观察。

3. 切片封片前需稍微吸干水分。