规格 Universal One-Step RT-qPCR Kit G3345-100 100 rxns 产品简介 本产品是使用嵌合荧光法对靶标RNA序列直接进行实时定量分析的试剂盒。在同一管中，RNA首先逆转录为cDNA，然后再进行qPCR反应，避免由于多次开盖造成样品间交叉污染的风险。经过改造的逆转录酶热稳定性显著提高，可对较复杂的模板进行有效逆转，逆转录预混液中还包含有RNA抑制剂，能够有效防止各种来源的RNA的降解。本产品提供的一步法RT-qPCR预混液为2×，其中除了包含热启动Taq DNA聚合酶，dNTP、Mg 2+ 、以及其他缓冲成分外，还具有独特的ROX Passive Reference Dye，可兼容多种qPCR仪器。预混液中还包含有观察反应体系是否建立的可视化示踪蓝色染料，该蓝色染料的光谱与qPCR荧光染料不重叠，不影响反应结果。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，有效期12个月。 组成 Component Number Component G3345- 100 G3345-1 RT Enzyme Mix 100 µL G3345-2 2×Universal Blue One-Step RT-qPCR Mix 1 mL G3345-3 Nuclease-Free Water 1 mL 说明书 1份 操作步骤 1. 反应体系（ 20 μ L ） Component Volume Final Concentration 2×Universal Blue One-Step RT-qPCR Mix 10 μL 1× RT Enzyme Mix 1 μL Forward Primer (10 μM) a 0.8 μL 0.4 μM Reverse Primer (10 μM) a 0.8 μL 0.4 μM Template RNA b Variable <1 μg (Total RNA) Nuclease-free Water Add to 20 μL a.引物终浓度使用范围0.2-1.0 μM，推荐引物浓度为0.4 μM。 b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。推荐模板用量为0.1 ng-100 ng。 2. 推荐的PCR反应程序（可根据机型适当调整）： A.两步法 B.三步法 阶段 步骤 循环数 温度 时间 阶段 步骤 循环数 温度 时间 Stage 1 逆转录 1 55℃ 10 min Stage 1 逆转录 1 55℃ 10 min Stage 2 预变性 1 95℃ 1 min Stage 2 预变性 1 95℃ 1 min Stage 3 变性 40 95℃ 15 sec Stage 3 变性 40 95℃ 15 sec 退火/延伸 60℃ 1 min a 退火 55-65℃ 20 sec 延伸 72℃ 30 sec a Stage 4 熔解曲线 1 仪器默认设置 Stage 4 熔解曲线 1 仪器默认设置 a.若需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；若需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。 注意事项 1. 2×Universal Blue One-Step RT-qPCR Mix使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡。 2. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。 3. 本制品中含有荧光染料，配制PCR反应液时应避免强光照射。 4. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头，尽量避免样品间的交叉污染。 5. 为了保证反应成功，请使用高质量的RNA模板。反复冻融的RNA模板会影响扩增，如需多次实验，可分装后进行冻存，减少冻融次数。 适配机型 ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoReal™ Cycler; Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™; Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex; IIIumina: Eco QPCR; Cepheid: SmartCycler®; Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列; Roche: LightCycler™ 系列; Takara: Thermal Cycler Dice系列; Analytikjena: qTOWER系列; 杭州博日: LineGene系列。 产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ （产品包装升级中，以实物为准。 ）