规格 2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) G3325-01 1 mL G3325-05 5×1 mL G3325-15 15×1 mL 产品描述 本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用2×预混液，包含除引物、DNA模板以外的所有qPCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。核心组分为基因工程改造后的热启动Taq DNA Polymerase，通过单克隆抗体与Taq DNA Polymerase高效结合，有效地封闭DNA聚合酶活性，阻止低温下的非特异性扩增，具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点，配以针对qPCR优化的反应Buffer，非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应。本产品是一种含有qPCR反应最适浓度SYBR Green I的2×预混试剂，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因定量准确、重复性好、可信度高，最快可30分钟完成qPCR反应。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输； -20℃避光保存，有效期12个月，避免反复冻融。解冻后可在4℃避光条件下稳定存放一个月。 组成 Component G 3325 -01 G 3325 -05 G 3325 -15 2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) 1 mL 5×1 mL 15×1 mL 说明书 1份 实验前准备 1. Real Time PCR 扩增仪； 2. 实验专用反应管或反应板； 3. PCR 引物（参考引物设计原则）； 4. 微量移液器和枪头（高压灭菌）。 操作步骤 1. 推荐PCR反应体系 Component 2 0 μL rxn 50 μL rxn Final Concentration 2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) 10 μL 25 μL 1× Forward Primer (10 μM) a 0.4 μL 1 μL 0.2 μM Reverse Primer (10 μM) a 0.4 μL 1 μL 0.2 μM Template b Variable Variable as required Nuclease-Free Water Add to 20 μL Add to 50 μL a : 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2 - 1.0 μM范围内调整引物浓度。 b : 模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反应的cDNA（RT 反应液）为模板时，添加量不要超过PCR反应液总体积的10%. 2. PCR反应程序（可根据机型适当调整） 阶段 步骤 循环数 温度 时间 Stage 1 预变性 1 95℃ 30 sec a Stage 2 变性 40 95℃ 3-10 sec b 退火/延伸 60℃ 10-30 sec c Stage 3 熔解曲线 1 仪器默认设置 推荐优先使用对应品牌荧光定量PCR仪快速程序，同时可兼容标准扩增程序；快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。 a : 基因组模板可以延长预变性时间2-3 min； b : 循环阶段：标准程序变性时间选择为10 sec，若扩增片段<200 bp，快速程序最短可选择为3 sec； c : 循环阶段：标准程序退火/延伸时间选择为30 sec；若扩增片段<200 bp，快速程序最短可选择为10 sec； 超过 200 bp时，推荐选择为30 sec；荧光信号采集请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置。 注意事项 1. 使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡，试剂混匀后再使用。试剂混合不均匀易造成反应效果不佳； 2. 配制反应液时，试剂请于冰上放置； 3. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制PCR反应液时应避免强光照射； 4. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头、尽量避免样品间的污染； 5. 避免反复冻融Master Mix，解冻后尽量在一个月内使用完毕。 适配机型 PCR仪品牌 G 332 3 (None ROX) G 332 4 ( Low ROX ) G 3325 (High ROX) ABI Thermo life PikoReal TM Cycler 7500/7500 Fast， ViiA 7™ QuantStudio™系列 5700/7000/7300/7700/7900/ 7900HT/7900 HT Fast，StepOne™，StepOne Plus™ Stratagene Mx3000P ® /3005P™/4000™ Bio-Rad 全系列 Eppendorf Realplex 2s，Mastercycler ® ep realplex IIIumina Eco QPCR Cepheid SmartCycler ® Qiagen Corbett Rotor-Gene ® 系列 Roche LightCycler™系列 Takara Thermal Cycler Dice系列 Analytikjena qTOWER系列 杭州博日 LineGene系列 引物设计原则 1. 扩增产物长度建议控制在80-300 bp之间； 2. 引物长度：18-25 bp； 3. 引物中碱基G＋C含量应在40%-60%之间； 4. 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过2℃为佳，Tm值控制在58-62℃为佳； 5. 碱基分布的随机性； 6. 引物最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹二级结构； 7. 两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3'端的互补重叠； 8. 建议引物的3'末端碱基为G或C； 9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。 常见问题及解决方法 问题描述 可能原因 解决办法 反应结束 后 无扩增曲线出现 或者Ct值出现过晚 模板浓度过低 减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。 模板降解 重新制备模板，重复实验。 体系中存在PCR抑制剂 一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验。 引物可能降解 长期未用的引物，应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。 扩增效率低 提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。 扩增产物过长 扩增产物长度控制在80-300 bp。 空白对照出现信号 反应体系污染 首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、PCR管或启用新的Master Mix； 反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。 出现引物二聚体等非特异性扩增 一般在35循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线进行分析； 重新设计引物，调整引物浓度或优化PCR反应程序。 熔解曲线出现多峰 引物设计不佳 根据引物设计原则重新设计新引物。 引物浓度过...