规格 2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (with UDG) G3328-01 1 mL G3328-05 5×1 mL G3328-15 15×1 mL 产品简介 本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用2×预混液。使用抗体法封闭的Taq DNA Polymerase再结合UDG（Uracil-DNA Glycosylase）和dUTP，一方面能有效降低引物二聚体的形成，增强特异性，提高灵敏度，另一方面可防止PCR扩增产物引起的交叉污染，对靶基因定量更加准确。同时本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye以及蓝色可视化加样示踪染料，可适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度。同时配套提供黄色模板稀释液，当用黄色模板稀释液稀释模板，并将其加入到蓝色反应预混液中，颜色由蓝色变为绿色，能够对配制反应体系过程起到示踪作用，防止漏加或错加。该蓝色与黄色染料的光谱与qPCR染料不重叠，不影响反应结果。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，有效期12个月。 组成 Component Number Component G3328-01 G3328-05 G3328-15 G3328-1 2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (with UDG) 1 mL 5×1 mL 15×1 mL G3328-2 40×Yellow Template Dilution Buffer 1 mL 1 mL 1 mL 说明书 1份 操作步骤 1. （可选）模板稀释 本试剂盒中提供40×Yellow Template Dilution Buffer，是40倍浓缩的黄色模板稀释液，用于DNA模板稀释，可通过液体颜色变化准确判断模板是否已经加入到qPCR反应液中。 以20 μL qPCR反应体系为例，根据加入到20 μL qPCR反应液中稀释后的模板量，对应原始模板稀释方法可参考下表（以原始模板稀释至100 μL为例）： 稀释后的模板 加入到 20 μL qPCR 反应液中的体积 ( μL ) 1 2 3 4 5 6 7 8 100 μL模板稀释体系中加入 40×Yellow Template Dilution Buffer的体积(μL) 50 25 16.7 12.5 10 8.4 7.2 6.3 原始模板加入到 100 μL模板稀释体系中的体积(μL) x x x x x x x x 补加Nuclease-free Water的体积(μL) 50-x 75-x 83.3-x 87.5-x 90-x 91.6-x 92.8-x 93.7-x 例：若 20 μ L qPCR反应体系中需加稀释后模板2 μ L。以100 μ L模板稀释体系为例，当加入原始模板体积x为20 μ L时，则需加入25 μ L 40×Yellow Template Dilution Buffer，再补加Nuclease- f ree Water 55 μ L至总体积为100 μ L，此时稀释后模板中40×Yellow Template Dilution Buffer即为10×。取2 μ L此稀释后的模板加入到20 μ L反应体系中，最终40×Yellow Template Dilution Buffer即为1×。总之，需保证在最终的qPCR体系中Yellow Template Dilution Buffer为1×。 注：如模板浓度过低无需稀释，或不想使用 G3328-2的模板稀释液，可忽略此步骤。 2. 推荐 qPCR反应体系： Component 20 μL rxn 50 μL rxn Final Concentration 2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (with UDG) 10 μL 25 μL 1× Forward Primer (10 μM) a 0.4 μL 1 μL 0.2 μM Reverse Primer (10 μM) a 0.4 μL 1 μL 0.2 μM Template b Variable Variable as required Nuclease-free Water Add to 20 μL Add to 50 μL a. 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好 扩增效果 。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。 b. 模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。 以 RT-PCR反应的cDNA（RT 反应液）为模板时，添加量不要超过 PCR反应液总体积的10%。 3. PCR反应程序（可根据机型适当调整）： A. 两步法 B. 三步法 阶段 步骤 循环数 温度 时间 阶段 步骤 循环数 温度 时间 Stage 1 UDG孵育 1 50℃ 2 min Stage 1 UDG孵育 1 50℃ 2 min Stage 2 预变性 1 95℃ 30 sec Stage 2 预变性 1 95℃ 30 sec Stage 3 变性 40 95℃ 15 sec Stage 3 变性 40 95℃ 15 sec 退火/延伸 60℃ 30 sec a 退火 55-65℃ 10 sec 延伸 72℃ 30 sec a Stage 4 熔解曲线 1 仪器默认设置 Stage 4 熔解曲线 1 仪器默认设置 a . 若需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度； 若 需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。 注意事项 1. 如不需要进行移液追踪，则不使用40×Yellow Template Dilution Buffer进行模板稀释。 2. 试剂使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡。 3. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。 4. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制PCR反应液时应避免强光照射。 5. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头，尽量避免样品间的交叉污染。 6. 避免反复冻融Master Mix，解冻后后尽量在一个月内使用完毕。 适配机型 ABI : 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler; Stratagene : Mx3000P®, 3005P™, 4000™; Bio-Rad : CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; Eppendorf : Realplex 2s, Mastercycler® ep, real...