规格 2×Universal Blue Probe qPCR Master Mix G3327-01 1 mL G3327-05 5×1 mL G3327-15 15×1 mL 产品简介 本产品是采用水解探针法进行qPCR反应的2×预混液。通过抗体法封闭Taq DNA Polymerase的活性，有效抑制引物二聚体的形成，提高扩增特异性与扩增效率，再搭配针对Probe qPCR优化的反应Buffer，可以在宽广的定量区域内得到良好的扩增曲线，对靶基因定量准确、重复性好、可信度高。同时本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye以及蓝色可视化加样示踪染料，可适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度。使用时只需要加入模板、引物、探针和Nuclease-free Water即可。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，有效期12个月。 组成 Component Number Component G33 27 -01 G33 27 -05 G3327- 1 5 G3327-1 2×Universal Blue Probe qPCR Master Mix 1 mL 5×1 mL 15×1 mL 说明书 1份 实验前准备 1. 实时荧光定量PCR仪。 2. 实验专用反应管或反应板。 3. PCR引物和探针（参考引物、探针设计原则）。 4. 微量移液器和吸头（高压灭菌）。 操作步骤 1. 推荐PCR反应体系 Component 20 μL rxn 50 μL rxn Final Concentration 2×Universal Blue Probe qPCR Master Mix 10 μL 25 μL 1× Forward Primer (10 μM) a 0.4 μL 1 μL 0.2 μM Reverse Primer (10 μM) a 0.4 μL 1 μL 0.2 μM Probe (10 μM) a 0.4 μL 1 μL 0.2 μM Template b Variable Variable as required Nuclease-free Water Add to 20 μL Add to 50 μL a.通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。 b.模板添加量因模板中靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反应的cDNA（RT 反应液）为模板时，添加量不要超过PCR反应液总体积的10%. 2. PCR反应程序（可根据机型适当调整） A. 两步法 B. 三步法 阶段 步骤 循环数 温度 时间 阶段 步骤 循环数 温度 时间 Stage 1 预变性 1 95℃ 30 sec Stage 1 预变性 1 95℃ 30 sec Stage 2 变性 40 95℃ 15 sec Stage 2 变性 40 95℃ 15 sec 退火/延伸 60℃ 30 sec a 退火 55-65℃ 10 sec 延伸 72℃ 30 sec a a ：需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。 注意事项 1. 使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡，试剂混匀后再使用。 2. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。 3. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制PCR反应液时应避免强光照射。 4. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头、尽量避免样品间的污染。 5. 避免反复冻融Master Mix，解冻后尽量在一个月内使用完毕。 适配机型 ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler; Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™; Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex; IIIumina: Eco QPCR; Cepheid: SmartCycler®; Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列; Roche: LightCycler™ 系列; Takara: Thermal Cycler Dice系列; Analytikjena: qTOWER系列; 杭州博日: LineGene系列。 Taqman引物设计原则 1. 先确定探针，再设计引物； 2. 在设计引物时，尽可能靠近探针，而不重叠探针； 3. 避免使用4个或4个以上连续的G； 4. 每个引物的Tm值应为58-60°C； 5. 引物末端最后5个核苷酸不能有超过2个G和C； 6. 引物最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹二级结构； 7. 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨外显子； 8. 扩增产物长度应为50-150bp，以获得最佳的PCR效率； 9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。 Taqman探针设计原则 1. 探针长度应为13-25bp(如果使用常规TaqMan探针，则为13-30bp)； 2. Tm值应为65°C~70°C，通常比引物Tm值高5~10℃，以确保在退火过程中探针优先与目的基因结合； 3. 对于一个引物，鸟嘌呤-胞嘧啶(G+C)的含量应在40%~70%之间； 4. 探针的5'端应避免使用G，因为5'端G会有淬灭作用，即使被切割下来，还会有淬灭作用。 5. 整条探针中，C的含量要明显高于G的含量，G的含量高会有淬灭作用，这时可以选择配对的另一条链作为探针。 Taqman MGB探针设计原则 1. 一种报告染料(例如，FAM™染料)连接到探针的5‘端； 2. 在探针的3‘端有一个非荧光猝灭基团(NFQ)； 3. MGB的部分附着在NFQ上，MGBs在不增加探针长度的情况下提高了退火温度(Tm)，所以可以设计更短的探针，但是不能少于13 bp； 4. 原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB就可以检测到(MGB探针将不会与目的基因结合，不产生荧光信号)。 产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ 版本号： V1. 1 -20210 7 （产品包装升级中，以实物为准。 ）