规格 2×LA PCR Master Mix G3307-01 1 mL G3307-05 5×1 mL 产品简介 本产品是含LA DNA聚合酶、反应缓冲液和dNTPs的2×预混液，有利于方便快速配制PCR反应体系。LA DNA聚合酶是混合酶，由经改造的Taq DNA Polymerase与一种含有3'→5'外切酶活性的DNA Polymerase组成，其保真性是Taq DNA Polymerase的6倍，扩增速度大约为10 s/kb。将快速扩增和高的持续合成能力与经特别优化的反应缓冲液结合，可从基因组中扩增长达30 kb的目的DNA片段，并且对不同来源、不同长度的模板均有较高的扩增效率，对于扩增10 kb以下的目的片段，产量明显提高。扩增产物3′末端带有“A”碱基，可直接克隆于T-Vector中。本产品含有两种示踪染料，PCR扩增完成之后可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，有效期12个月，避免反复冻融。 组成 Component G33 07 - 01 G33 07 - 05 2× LA PCR Master Mix 1 mL 5×1 mL 说明书 1份 操作步骤 1.推荐PCR反应体系: Component 20 μL反应体系 50 μL反应体系 Final Concentration Template a Variable Variable as required Forward Primer (10 μM) b 1.0 μL 2.5 μL 0.5 μM Reverse Primer (10 μM) b 1.0 μL 2.5 μL 0.5 μM 2×LA PCR Master Mix 10 μL 25 μL 1× (DMSO, optional c ) (0.6 μL) (1.5 μL) (3%) ddH2O Add to 20 μL Add to 50 μL a：以质粒或噬菌体DNA为模板时，推荐添加量为10 ng-1 pg每50 μL体系；以基因组DNA为模板时，推荐添加量为250 ng-50 ng每50 μL体系；cDNA为模板时，推荐稀释2-100倍，添加量不超过总体系的10%。过量的模板容易导致非特异扩增，过少的模板容易导致PCR扩增效率低。 b：引物终浓度使用范围0.2-1.0 μM，推荐引物浓度为0.5 μM，过少的引物可能会导致扩增产量低或无扩增，过量的引物可能会导致非特异扩增。 c：高GC模板可在反应体系中额外添加不超过总体积10%的DMSO。 2. 推荐PCR扩增条件: Step Temperature Time Cycles Initial Denaturation a 95℃ 30-120 s 1 Denaturation 95℃ 5-10 s 25-35 Annealing b 50-72℃ 10-30 s Extension c 72℃ 5-15 s/kb Final extension 72℃ 5-10 min 1 Hold 4-16℃ Forever a：预变性时间30 s适用于大多数常规模板，复杂模板可延长变性时间至2 min。 b：短的变性时间有利于20 kb以上的长片段扩增。 c：对于复杂模板，含兼并引物的扩增，退火时间可延长至30 s；当退火温度在68~70℃之间时，将退火/延伸温度合并为退火温度，可以显著提高扩增特异性。 d：质粒等简单模板推荐延伸速度5-10 s/kb；常规基因组模板推荐延伸速度10-15 s/kb；复杂模板15-30 s/kb。 注意事项 1. 针对不同类型模板，模板用量需要适量，需根据实际扩增情况进行调整。 2. 扩增15 kb以上的片段可适当调整dNTPs和引物的用量，引物设计长度在25 bp~35 bp之间，建议使用试剂盒提取高质量模板。 3. 不同PCR仪和PCR反应管也会影响长片段扩增。 4. 引物设计需要遵循引物设计原则。 5. 对于复杂模板，需要调节退火温度和延长延伸时间来实现高效扩增。 6. 使用前彻底解冻混匀，完全融解后可置于4℃稳定保存至少2周，避免反复冻融。 7. 操作时请佩戴一次性手套，穿实验服。 产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ （产品包装升级中，以实物为准。 ）