规格 Vaccinia Capping Enzyme G3454-500U 500 U 产品简介 Vaccinia Capping Enzyme是来源于牛痘病毒加帽酶，由大肠杆菌重组表达，可以将7-甲基鸟苷帽结构(m7Gppp, Cap 0)加到RNA的5' 末端。真核生物中，此结构与mRNA的稳定、转运和翻译紧密相关。加帽酶由两个亚基（D1和D12）组成，D12亚基为调节亚基，D1亚基具有三种酶活性（RNA三磷酸酶、鸟苷酸转移酶和鸟嘌呤甲基转移酶），所有活性才能添加一个完成的Cap 0结构m7Gppp5‘N到5’三磷酸RNA。加帽酶体外RNA加帽的效率很高，几乎100%有效，与一些帽类似物的共转录添加不同。主要用于体外mRNA合成。 来源： 来源于牛痘病毒，由大肠杆菌重组表达； 酶活定义： 在37℃条件下，1 h内将10 pmol GTP（α- 32 P）掺入到80 nt核苷酸转录产物上所需要的酶量定义为一个酶活单位。 纯度及浓度： SDS-PAGE检测纯度≥95%；内源性核酸残留量＜1 pg/μL（qPCR检测）；10 U/μL。 酶存储buffer： 20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% Glycerol，0.1%（w/v）Triton X-100，pH 8.0。 10х Capping Buffer： 500 mM Tris-HCl，50 mM KCl，10 mM MgCl2，10 mM DTT，pH 8.0。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，12个月有效期。 组成 Component Number Component G 3454-500U G3454-1 Vaccinia Capping Enzyme 50 μL G3454-2 10х Capping Buffer 200 μL G3454-3 GTP（10 mM） 50 μL G3454-4 SAM（32 mM） 20 μL G3454-5 Nuclease-Free water 1 mL 说明书 1份 操作步骤 加帽反应： 1. 取10 μg RNA至1.5 mL离心管中，使用Nuclease-Free water稀释至15 μL，65℃加热5 min； 2. 将加热后的离心管于冰上放置5 min； 3. 按下表加入各个组分： Component Volume 经上述处理后的变性RNA 15 μL 10х Capping Buffer 2 μL GTP（10 mM） 1 μL SAM（2 mM） 1 μL Vaccinia Capping Enzyme 1 μL 4. 体系于37℃孵育30 min，RNA即可加帽完成；（反应时间可以调整） 5. 若加帽的Cap 0 RNA需要2‘-O甲基化，可使用2'-O-Methyltransferase；若加帽好的RNA需要加上Poly（A）尾，可使用Poly(A) RNA Polymerase。 5‘末端标记反应 1. 取适量的RNA至1.5 mL离心管中，使用Nuclease-Free water稀释至14 μL，65℃加热5 min； 2. 将加热后的离心管于冰上放置5 min； 3. 按下表加入各个组分： Component Volume 经上述处理后的变性RNA 14 μL 10х Capping Buffer 2 μL GTP Mix（10 mM） 2 μL SAM（2 mM） 1 μL Vaccinia Capping Enzyme 1 μL 注：本实验适用于5‘末端带有三磷酸的RNA标记反应，可以根据需求放大，标记效率受反应体系中RNA与GTP的摩尔浓度比及RNA样品中GTP的含量影响。GTP Mix为GTP和少量标记物，其中GTP储液应为mRNA摩尔浓度的1-3倍。 4. 体系于37℃孵育30 min，RNA 5‘末端标记完成；（反应时间可以调整） 5. 若加帽的Cap 0 RNA需要2‘-O甲基化，可使用2'-O-Methyltransferase；若加帽好的RNA需要加上Poly（A）尾，可使用Poly(A) RNA Polymerase。 注意事项 1. 涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理以去除RNase或者确保是RNase free的。 2. 反应热处理RNA，用于去除5‘末端的二级结构，若5’端结构复杂可以延长时间至10 min。 3. 若加帽效果不佳，可延长反应时间至1 h，以提高加帽效率。 4. SAM在pH 7-8、37℃条件下不稳定，需要在反应前新鲜配置。在反应开始前将32mM SAM稀释成4 mM的工作液，为避免SAM降解，整个过程需要置于冰上。 5. 建议适用RNase抑制剂防止RNA在反应中发生降解。可以加入终浓度1 U/μL的RNase抑制剂（ G3414 ）。 6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ （产品包装升级中，以实物为准。 ）