规格 无内毒素质粒DNA中提试剂盒 G3648-10T 10T 产品简介 本试剂盒是采用对质粒具有专一吸附作用的玻纤膜，再结合特殊的缓冲Buffer组合，可以有效地从培养的细菌中提取各种无内毒素质粒（内毒素含量≤0.1 EU/μg），根据质粒拷贝数的不同，质粒得量在100-400 μg，提取的高纯度质粒可应用于后续的酶切反应、连接反应、PCR扩增、测序、转化、转染等多种生物学实验。 储存与运输 RNase A冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其余试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。 组成 Component Number Component G36 48 - 10 T G3648-1 Buffer BL 25 mL G3648-2 Buffer P1 30 mL（使用前加入RNase A） G3648-3 Buffer P2 30 mL G3648-4 Buffer P3 30 mL G3648-5 RNase A 600 μL G3648-6 Buffer ER 10 mL G3648-7 Buffer ED 40 mL G3648-8 Buffer PW 16 mL（使用前加入64 mL无水乙醇） G3648-9 Buffer TE 15 mL G3648-10 Column Filters 10个 G3648-11 HiBind DNA Midi Columns 10个 G3648-12 15 mL Centrifuge Tubes 10个 说明书 1份 使用前准备 1. 自备无水乙醇。 2. 准备42℃水浴或加热模块。 3. 使用前先将RNase A全部加入Buffer P1中，并于4℃可保存6个月。 4. Buffer PW使用前加入64 mL的无水乙醇。 5. Buffer P2如出现沉淀，请于37℃水浴中加热几分钟即可恢复澄清，使用后应立即盖紧盖子，避免试剂长时间与空气接触。 6. Buffer P3使用前请于4℃预冷。 实验步骤 1. 柱平衡步骤：向HiBind DNA Midi Column中加入2 mL Buffer BL，4500×g室温离心2 min，弃掉废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回 Collection Tube 中（处理过的柱子最好立即使用）； 2. 取20-50 mL过夜培养菌液，8000×g室温离心1 min收集菌体于50 mL离心管中（尽量将上清全部去除），低拷贝或大于10 kb的质粒建议适当增大菌体量，并等比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量； 3. 加入2.5 mL Buffer P1（请先确认是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮菌体（务必使菌体彻底分散，否则会影响裂解，导致提取质粒的质量和纯度偏低）； 4. 加入2.5 mL Buffer P2，立即温和地上下颠倒8-10次使菌体充分裂解（此步不可剧烈震荡，避免造成基因组DNA剪切断裂，并且应保证在5 min以内完成），此时溶液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮可能是菌体过多，裂解不彻底，应考虑降低菌体量； 5. 加入2.5 mL Buffer P3（提前4℃预冷）立即温和地上下颠倒10-12次充分混匀，溶液出现紧实凝集块，8000×g室温离心15 min，将上清慢慢地全部倒入Column Filter中，推动推柄过滤，滤液收集于15 mL Nuclease-free离心管（自备）中； 6. 加入750 μL Buffer ER，颠倒混匀后冰上放置10 min（期间颠倒混匀3-5次），溶液呈透明蓝色； 7. 42℃孵育5 min溶液恢复浑浊，4500×g室温离心5 min （离心机温度必须恢复至室温，否则会影响分层） ，此时溶液分为上下两层 （如果分层不明显，室温放置1-3 min） ，上层为澄清水相，下层为蓝色，小心收集上层水相至新的15 mL Nuclease-free离心管（自备）中; 8. 加入0.5倍上述溶液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后将溶液转移到HiBind DNA Midi Column中（每次加入液体量不超过4 mL）； 9. 4500×g室温离心3 min，弃掉 Collection Tube 中的废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回 Collection Tube 中（第8步的溶液需进行多次过柱）； 10. 向吸附柱中加入3.5 mL Buffer ED 4500×g室温离心3 min，弃掉 Collection Tube 中的废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回 Collection Tube 中； 11. 向HiBind DNA Midi Column中加入3.5 mL Buffer PW（确认是否加入无水乙醇），4500×g室温离心3 min，弃掉 Collection Tube 中的废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回 Collection Tube 中； 12. 重复操作步骤11； 13. 4500×g室温离心10 min，然后将HiBind DNA Midi Column置于15 mL Centrifuge Tube中，开盖室温放置10 min，使乙醇彻底挥发； 14. 向HiBind DNA Midi Column的膜中间部位悬空滴加500-1000 μL Buffer TE或Endo-free Water，室温放置5 min，4500×g离心5 min。如果需要增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到HiBind DNA Midi Column中，室温放置5 min后，4500×g离心5 min； 15. 得到的质粒DNA可于-20℃长期保存。 注意事项 1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。 2. 避免直接接触Buffer P2、P3，ED使用后应立即盖紧盖子。 3. 提取的质粒为低拷贝质粒或者质粒大于10 kb时，应增加菌体收集量，同时等比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量。 4. 可将洗脱液于60-65℃预热，并延长洗脱孵育时间，可提高洗脱效率。 5. 洗脱质粒前应使乙醇完全挥发，避免残留的乙醇影响下游实验。 6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ 附操作流程简图 （产品包装升级中，以实物为准。 ）