规格 质粒DNA大提试剂盒 G3683-10T 10T 产品简介 本试剂盒采用经典的碱裂解法和硅胶膜对核酸可逆性结合的方法，可从100 mL过夜培养的大肠杆菌中提取500 µg-1500 µg的质粒DNA。提取的质粒DNA可直接用于酶切反应、连接反应、PCR扩增、测序、转化等各种分子生物学实验。 储存与运输 RNase A冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其他试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。 组成 Component Number Component G3683 -10 T G3683-1 Buffer BL 30 mL G3683-2 Buffer P1 100 mL（使用前加入RNase A） G3683-3 Buffer P2 100 mL G3683-4 Buffer P3 100 mL G3683-5 RNase A 200 μL G3683-6 Buffer PD 50 mL（使用前加入75 mL无水乙醇） G3683-7 Buffer PW 70 mL（使用前加入163 mL无水乙醇） G3683-8 Buffer TE 30 mL G3683-9 Column Filters 10个 G3683-10 HiBind DNA Columns 10个 G3683-11 50 mL Collection Tubes 10个 说明书 1份 使用前准备 1. 自备无水乙醇和50 mL Nuclease-free的离心管。 2. 使用前先将RNase A全部加入Buffer P1中，并于2-8℃可保存6个月。 3. 使用前向Buffer PD加入75 mL无水乙醇，向Buffer PW加入163 mL的无水乙醇。 4. Buffer P2如出现沉淀，请于37℃水浴中加热几分钟即可恢复澄清，使用后应立即盖紧盖子，避免试剂长时间与空气接触。 5. Buffer P3使用前请于4℃或冰浴预冷。 实验步骤 1. 柱平衡步骤：向HiBind DNA Column中加入2.5 mL Buffer BL，10,000×g离心2 min，弃掉废液，将HiBind DNA Column重新放回 Collection Tube 中（处理过的柱子最好当天使用）； 2. 取100 mL过夜培养菌液，10,000×g室温离心1 min收集菌体于50 mL离心管中（尽量将上清全部去除），低拷贝或质粒DNA大于10 kb建议收集200 mL过夜培养的菌体，并等体积的增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量； 3. 加入8 mL Buffer P1（请先检查是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮菌体（务必使菌体彻底分散，否则会影响裂解，导致提取质粒的质量和纯度偏低）； 4. 加入8 mL Buffer P2立即温和的上下颠倒8-10次使菌体充分裂解（此步不可剧烈震荡，避免造成基因组DNA剪切断裂，并且应保证在5 min以内完成），此时溶液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮可能是菌体过多，裂解不彻底，可再次轻轻颠倒5-8次，直到溶液彻底清亮； 5. 加入8 mL Buffer P3（提前4℃预冷），立即温和的上下颠倒10-12次充分混匀，溶液出现紧实凝集块，10,000×g离心10-15 min，将上清慢慢地全部倒入Column Filters中，推动推柄过滤，滤液收集于Nuclease-free的50 mL离心管（自备）中； 6. 加入0.5倍上述溶液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后转移到HiBind DNA Column中（每次加入液体量不超过10 mL）； 7. 室温10,000×g离心2 min，弃掉 Collection Tube 中的废液，将HiBind DNA Column重新放回 Collection Tube 中（第6步的溶液需进行多次过柱）； 8. 向吸附柱中加入10 mL Buffer PD（确认是否加入无水乙醇），10,000×g离心2 min，弃掉 Collection Tube 中的废液，将HiBind DNA Column重新放回 Collection Tube 中； 9. 向HiBind DNA Column中加入10 mL Buffer PW（确认是否加入无水乙醇）10,000×g离心2 min，弃掉 Collection Tube 中的废液，将HiBind DNA Column重新放回 Collection Tube 中； 10. 重复操作步骤9； 11. 10,000×g离心5 min，将HiBind DNA Column置于新的50 mL Collection Tube 中开盖室温放置10 min，使乙醇彻底挥发； 12. 向HiBind DNA Column的膜中间部位悬空滴加1-1.5 mL Buffer TE或Nuclease-free Water，室温放置5 min，10,000×g离心5 min。如果需要增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到HiBind DNA Columns中，室温放置5 min后，10,000×g离心5 min； 13. 得到的质粒DNA可于-20℃长期保存。 注意事项 1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。 2. 低拷贝或质粒DNA大于10 kb建议收集200 mL过夜培养的菌体，并等体积的增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量 3. 可将洗脱液于60-65℃预热，并延长孵育时间，可提高洗脱效率。 4. 洗脱质粒前应使乙醇完全挥发，避免残留的乙醇影响下游实验。 5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ 附操作流程简图 （产品包装升级中，以实物为准。 ）