规格 质粒DNA中提试剂盒 G3649-10T 10T 产品简介 本试剂盒采用经典的碱裂解法和玻纤膜对质粒高效、特异结合的纯化方式，适用于从20-50 mL培养的细菌中纯化高纯度质粒，根据质粒拷贝数的不同，得量在100-400 μg之间。提取的质粒可直接用于后续酶切反应、连接反应、PCR扩增、测序、转化等各种分子生物学实验。 储存与运输 RNase A冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其余试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。 组成 Component Number Component G36 49-10 T G3649-1 Buffer BL 25 mL G3649-2 Buffer P1 30 mL（使用前加入RNase A） G3649-3 Buffer P2 30 mL G3649-4 Buffer P3 30 mL G3649-5 RNase A 600 μL G3649-6 Buffer PD 16 mL（使用前加入24 mL无水乙醇） G3649-7 Buffer PW 16 mL（使用前加入64 mL无水乙醇） G3649-8 Buffer TE 15 mL G3649-9 Column Filters 10个 G3649-10 HiBind DNA Midi Columns 10个 G3649-11 15 mL Centrifuge Tubes 10个 说明书 1份 使用前准备 1. 自备无水乙醇。 2. 使用前先将RNase A全部加入Buffer P1中，并于2-8℃可保存6个月。 3. Buffer PD使用前加入24 mL无水乙醇。 4. Buffer PW使用前加入64 mL无水乙醇。 5. Buffer P2如出现沉淀，请于37℃水浴中加热几分钟即可恢复澄清，使用后应立即盖紧盖子，避免试剂长时间与空气接触。 6. Buffer P3使用前请于4℃预冷。 实验步骤 1. 柱平衡步骤：向HiBind DNA Midi Column中加入2 mL Buffer BL，4500×g室温离心2 min，弃掉废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回 Collection Tube 中（处理过的柱子最好立即使用）； 2. 取20-50 mL过夜培养菌液，8000×g室温离心1 min收集菌体于50 mL离心管中（尽量将上清全部去除），低拷贝或大于10 kb的质粒建议适当增大菌体量，并等比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量； 3. 加入2.5 mL Buffer P1（请先检查是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮菌体（务必使菌体彻底分散，否则会影响裂解，导致提取质粒的质量和纯度偏低）； 4. 加入2.5 mL Buffer P2，立即温和地上下颠倒8-10次使菌体充分裂解（此步不可剧烈震荡，避免造成基因组DNA剪切断裂，并且应保证在5 min以内完成），此时溶液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮可能是菌体过多，裂解不彻底，应考虑降低菌体量； 5. 加入2.5 mL Buffer P3（提前4℃预冷），立即温和地上下颠倒10-12次充分混匀，溶液出现紧实凝集块，8000×g室温离心15 min，将上清慢慢地全部倒入Column Filter中，推动推柄过滤，滤液收集于15 mL Nuclease-free离心管（自备）中； 6. 加入0.5倍上述溶液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后将溶液转移到HiBind DNA Midi Column中（每次加入液体量不超过4 mL）； 7. 4500×g室温离心3 min，弃掉 Collection Tube 中的废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回 Collection Tube 中（第6步的溶液需进行多次过柱）； 8. 向HiBind DNA Midi Column中加入3.5 mL Buffer PD（确认是否加入无水乙醇），4500×g室温离心3 min，弃掉 Collection Tube 中的废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回 Collection Tube 中； 9. 向HiBind DNA Midi Column中加入3.5 mL Buffer PW（确认是否加入无水乙醇），4500×g室温离心3 min，弃掉 Collection Tube 中的废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回 Collection Tube 中； 10. 重复操作步骤9； 11. 4500×g室温离心10 min，然后将HiBind DNA Midi Column置于15 mL Centrifuge Tube中，开盖室温放置10 min，使乙醇彻底挥发； 12. 向HiBind DNA Midi Column的膜中间部位悬空滴加500-1000 μL Buffer TE或Nuclease-free Water，室温放置5 min，4500×g离心5 min。如果需要增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到HiBind DNA Midi Column中，室温放置5 min后，4500×g离心5 min； 13. 得到的质粒DNA可于-20℃长期保存。 注意事项 1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。 2. 提取的质粒为低拷贝质粒或者质粒大于10 kb时，应增加菌体收集量，同时等比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量。 3. 可将洗脱液于60-65℃预热，并延长孵育时间，可提高洗脱效率。 4. 洗脱质粒前应使乙醇完全挥发，避免残留的乙醇影响下游实验。 5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ 附操作流程简图 （产品包装升级中，以实物为准。 ）