规格 2×In-Fusion Cloning Mix G3350-10T 10T G3350-20T 20T G3350-100T 100T 产品简介 2×In-Fusion Cloning Mix可以将单个或2~3个多片段快速定向连接克隆至载体中，尤其适用于单片段连接，2-3片段连接效率会有降低。使用任意方式将载体线性化，在插入到线性化载体中的DNA片段正/反向扩增引物5'端引入线性化载体的末端序列，使得PCR扩增产物的5'和3'末端分别带有与线性化载体末端一致的序列(15-25 bp)。在2×In-Fusion Cloning Mix预混液中，按一定比例混合这种两端带有与线性化载体末端一致序列的PCR产物和线性化载体，然后冰上(或冰水混合物中)孵育5 min，即可进行转化感受态细胞，完成定向克隆。 本预混液可实现高效快速的DNA无缝克隆，可用于重组质粒或基因点突变重组质粒的构建，该预混液不依赖于连接酶体系，大大降低载体自连背景，同时无需考虑插入片段自身含有的限制性内切酶位点。对于单片段DNA重组质粒的构建，使用该预混液获得的阳性克隆子比例高达99%。使用本预混液不依赖于恒温设备，且在数小时内即可完成从DNA样品制备到重组产物的转化涂板培养的全部操作，大大节省时间。 引物设计原则 （1）单片段引物设计：插入片段扩增引物5’端分别引入与线性化载体两端一致的15-25 bp序列。设计如下图： （2）多片段引物设计：载体两端的引物设计原则与单片段引物设计原则相同。片段之间重置区域引物设计原则如下：Fragment 1的反向引物和Fragment 2的正向引物有15-25 bp的重叠区域，Fragment 1的反向引物包括重叠区域和反向的特异引物区域, Fragment 2的正向引物包括重叠区域和正向的特异引物区域,依此类推(红色为重叠区域)。为了提高效率，可增加片段之间的重叠区域并保证其Tm值一致。设计如下图： 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；-20℃保存。有效期12个月。 组成 Component G3350 -20T G3350-100T 2×In-Fusion Cloning Mix 100 μL 5×100 μL pUC19 (Linearized, Control Vector, 5 ng/μL) 10 μL 10 μL Control Insert (10 ng/μL) 10 μL 10 μL 说明书 1份 操作步骤 1，参考反应体系（10 μL反应体系）： Component Volume 2×In-Fusion Cloning Mix 5 μL Vector X μL DNA Segment Y μL Nuclease-Free Water Add To 10 μL 2，将装上述反应体系的EP管于冰水浴(冰水混合物)条件下孵育 5-10 min，即可立即进行后续转化操作； 3，转化标准操作步骤： a ，从 -80℃ 冰箱取出感受态细胞(如 E. coli DH5α 、 E. coli Top10等)放置冰上解冻； b，将反应 后的 样品加入到感受态中，手指轻轻拨动管底混匀，冰浴 30 min ； c，然后产物放置于 42℃ 水浴锅热激 90 s ，结束后，迅速置于冰上，冰浴2- 5 min ； d，取 900 μL无菌的SO C或 LB 培养基加入EP管中，混匀后，将 EP 管置于摇床上， 220 rpm ， 37℃ 培养 1 h复苏细菌 （也可置于 37℃ 培养箱静置培养1 h）； e，根据实验需求，吸取不同体积已转化感受态细胞加到含有相应抗生素的LB固体培养基上，将细胞均匀涂布开，待液体完全吸收后将平板倒置于 37℃ 培养箱，过夜 培养 ； 4，阳性克隆鉴定： 挑取平板的上生长出来的单克隆菌落进行菌落PCR鉴定、或经培养后提取质粒酶切或PCR鉴定、或将提取的质粒直接测序分析鉴定。 注意事项 1. 载体和目的片段务必进行凝胶纯化并电泳检测其质量和浓度，浓度低时可以不加水，直接用其补足。 2. 多片段重叠区域之间的Tm值需保持一致且>60℃。 3. 建议载体与插入片段摩尔比1:1~1:3；2-3片段连接时各片段之间摩尔比为1:1，2-3片段连接效率会降低，可等比例放大连接反应体系。 4. 当载体和插入片段总体积大于5 μL时，可将反应体系放大至20 μL。 5. 连接产物的体积不宜超过感受态细胞体积的1/10，否则会显著降低转化效率，可以等比例增加连接产物和感受态细胞体积（如20 μL连接体系转化200 μL感受态细胞）。 6. 2×In-Fusion Cloning Mix建议使用时取出，用完后立即放回-20℃，解冻后可分装冻存以减少反复冻融次数。 7. 当使用电穿孔法转化时，反应产物需经柱式法或乙醇沉淀法等纯化DNA。 不同类型质粒构建实验流程简图 1. 重组质粒构建实验流程简图 A. PCR扩增获得插入DNA片段 ： 在目的片段正/反向引物的5'端引入15-25 bp线性化载体末端的同源序列（绿色和浅蓝色标示），PCR扩增目的片段，使得扩增产物5'和3'末端序列分别和线性化载体两末端序列完全一致。 B. 载体线性化： 限制性内切酶酶切或反向PCR获得线性化载体； C. In-Fusion Cloning: 将线性化载体和纯化回收后的插入片段按照比例混合，冰水混合物(0℃)中反应5-10 min即可完成反应； D. 转化感受态细胞： 反应产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，从平板上挑取生长出来的单克隆菌落进行PCR、酶切或测序等实验筛选阳性克隆子。 2. 单点基因突变重组质粒构建实验流程简图 A. 两片段PCR（ PCR扩增突变位点两端DNA片段 ）： 在基因突变位点设计互补引物（橙色标示），同时在突变基因两端设计引物引入15-25 bp线性化载体末端的同源序列（绿色和浅蓝色标示），使用不同引物对将突变基因分两片段分别PCR扩增获得带有同源序列的两个插入片段（分别包含基因突变位点）。 B. 载体线性化： 限制性内切酶酶切或反向PCR获得线性化载体； C. In-Fusion Cloning: 将线性化载体和纯化回收后的插入片段按照比例混合，冰水混合物(0℃)中反应5-10 min即可完成反应； D. 转化感受态细胞： 反应产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，从平板上挑取生长出来的单克隆菌落进行PCR、酶切或测序等实验筛选阳性克隆子。 3. 两片段插入重组质粒构建 实验流程简图 A. 分别 PCR扩增两个片段 ： 扩增引物设计时在其5'端添加同源序列（绿色、浅蓝色、深蓝色标示），使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有一段15-25 bp左右的同源序列，使用不同引物对分别PCR扩增两个DNA片段（橙色和紫色标示）。 B. 载体线性化： 限制性内切酶酶切或反向PCR获得线性化载体； C. In-Fusion Cloning: 将线性化载体和纯化回收后的插入片段按照比例混合，冰水混合物(0℃)中反应5-10 min即可完成反应； D. 转化感受态细胞： 反应产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，从平板上挑取生长出来的单克隆菌落进行PCR、酶切或测...