规格 pSWE-Topo Zero Cloning Kit G3022-25T 25T 产品简介 本公司生产的pSWE-Topo Zero Cloning Kit，是一种通过自杀基因的表达与否进行阳性重组子筛选的载体，由pUC19载体改造而成。当目的基因片段没有连接到载体中时，自杀基因成功正确表达，包含载体的细胞无法生长；当目的基因片段成功连接到载体中时，自杀基因将无法正确表达，包含载体的细胞可以正常生长，这种载体也被称为“Zero”背景载体。同时本公司的pSWE-Topo Zero Cloning Kit使用一种新的载体连接方式，不需要额外加入连接酶进行片段与载体的连接反应，只需要将目的基因片段加入到载体中，室温（22℃-37℃）反应5 min即可进行转化操作。pSWE-Topo Zero Cloning Kit能够兼容TA克隆与平末端克隆。 特点： 使用方便，兼容TA克隆与平末端克隆；不需要进行额外的酶连反应，体系中加入目的基因片段，室温5 min即可进行正常转化操作；阳性率可达95%；短、长片段克隆都适用； 筛选标记为氨苄青霉素 ； 测序引物：M13 Forward Primer （5‘TGTAAAACGACGGCCAGT’3） ，M13 Reverse Primer （5‘CAGGAAACAGCTATGACC’3） 。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，有效期12个月。 组成 Component Number Component G 3022-25T G3022-1 pSWE-Topo Zero Vector (50 ng/μL) 25 μL G3022-2 Control Template (700 bp, 50 ng/μL) 10 μL G3022-3 M13 Forward Primer (10 μM) 50 μL G3022-4 M13 Reverse Primer (10 μM) 50 μL 说明书 1份 操作步骤 1. PCR产物的准备 （1）引物不能磷酸化；（2）PCR反应使用高保真及Taq DNA Polymerase均可；（3）PCR产物推荐电泳后使用凝胶回收试剂盒进行纯化。 2. 参考反应体系： Component Volume pSWE-Topo Zero Vector (50 ng/μL) 1 μL 基因片段 0.5-4 μL 插入片段推荐用量：载体与片段摩尔比=1:10-1:3。可以粗略地按照1 kb片段加入50 ng的量计算 。 如果构 建基因文库可适当扩大反应体系 。 3. 按上述参考反应体系轻轻混合载体与基因片段，室温（20-37℃）反应5-10 min，将离心管置于冰上。 4. 转化： a，在反应体系中加入50-100 μL克隆感受态（或将反应产物加入50-100 μL克隆感受态中），轻轻混匀，冰浴30 min；b，将转化体系立即于42℃热激45 s，立即置于冰上2-3 min；c，在转化体系中加入200 μL平衡至室温的SOC或LB培养基，200 rpm、37℃孵育1 h；d，取200 μL菌液涂布抗性平板，37℃倒置培养过夜（为得到较多克隆，可以离心后去掉部分上清，将菌液全部涂布抗性平板）。 5. 阳性转化子检测： a. 菌落PCR鉴定阳性克隆：挑取单克隆至10 μL无菌水中，涡旋混合，然后取1 μL混合液作为PCR模板，M13 Forward Primer和M13 Reverse Primer作为通用引物，进行菌落PCR鉴定阳性克隆。（ 推荐 G3304 、 G3305 ； PCR反应体系及程序参考相应产品说明书 ， 阳性克隆PCR扩增片段＞100 bp ） b. 酶切鉴定阳性克隆：挑取单克隆接种于适量抗性液体培养基中，220rpm、37℃过夜培养。小量提取质粒，用适宜的限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳鉴定阳性克隆。 c. 测序鉴定阳性克隆：使用M13 Forward Primer，M13 Reverse Primer引物测序并分析。 注意事项 1. 在使用该产品时宜将产品存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后该立即放置于-20℃保存。 2. 大肠杆菌菌株DB3.1、ccdB Survival、Stable、JM109、XL1-Blue和XL10-Gold，这些菌株可以耐受CcdB，可以用于繁殖或保存含ccdB的质粒，因此不适用pSWE-Topo Zero Vector进行筛选。其他实验室常用的DH5α、Top10、TG1等不耐受Ccdb的大肠杆菌感受态细胞均适用。 3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 附图： 图 1. pSWE-Topo Zero Vector结构示意图及目的基因插入载体局部序列 载体全序列： GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGCCCTT NNNNNNN AAGGGCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAACAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCGGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACA...