规格 2×In-Fusion Cloning Mix Plus G3351-20T 20T G3351-100T 100T 产品简介 本产品2×In-Fusion Cloning Mix Plus是2×In-Fusion Cloning Mix（ G3350 ）升级产品。2×In-Fusion Cloning Mix Plus可以兼容单个或2~5个多片段定向重组至载体中。使用合适方式将载体线性化，在插入到线性化载体中的目标DNA片段正/反向扩增引物5'端引入线性化载体的末端序列，使得PCR扩增产物的5'和3'末端分别带有与线性化载体末端一致的序列(15-25 bp)。在2×In-Fusion Cloning Mix Plus预混液中，按一定比例混合这种两端带有与线性化载体末端一致序列的PCR产物和线性化载体，50℃反应15-30 min，即可进行转化感受态细胞，完成定向克隆。 升级的2×In-Fusion Cloning Mix Plus，显著提高克隆的重组效率。对于单片段DNA重组质粒的构建，使用该预混液获得的阳性克隆子比例高达99%；而对于2~5个多片段DNA重组质粒的构建，使用该预混液获得的阳性克隆子比例高达90%。而多片段的同时插入，极大的简化了实验步骤，提高效率，节约时间。 引物设计 (1)单片段引物设计：插入片段扩增引物5'端分别引入与线性化载体两端一致的15-25 bp序列。设计如下图： (2) 多片段引物设计：载体两端的引物设计原则与单片段引物设计原则相同。片段之间重置区域引物设计原则如下：Fragment 1的反向引物和Fragment 2的正向引物有15-25 bp的重叠区域，Fragment 1的反向引物包括重叠区域和反向的特异引物区域, Fragment 2的正向引物包括重叠区域和正向的特异引物区域,依此类推(红色为重叠区域)。为了提高效率，可增加片段之间的重叠区域并保证其Tm值一致。设计如下图： 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，有效期12个月。 组成 Component G3351-20T G3351-100T 2×In-Fusion Cloning Mix Plus 100 μL 5×100 μL pUC19 (Linearized, Control Vector, 5 ng/μL) 10 μL 10 μL Control Inset (10 ng/μL) 10 μL 10 μL 说明书 1份 连接体系（推荐10 μL反应体系） Component Volume 2×In-Fusion Cloning Mix Plus 5 μL Vector X μL DNA segment Y μL Nuclease-Free Water Add To 10 μL （注：10μL反应体系载体加入量推荐5-150 ng；1 μg 1000bp dsDNA约1.65 pmol；建议载体与插入片段摩尔比1:1~1:3） 反应条件 1. 对于单片段重组反应，水浴50℃保持15 min；立即置于冰上冷却。 2. 对于多片段重组反应，水浴50℃保持30 min；立即置于冰上冷却（3~5个多片段重组时，适当延长重组时间可提高重组效率，但最长不宜超过1 h）。 反应产物转化 1. 从-80℃冰箱取出感受态细胞(如 E. coli DH5α、 E. coli Top10等)放置冰上解冻； 2. 将反应后的样品加入到感受态中，手指轻轻拨动管底混匀，冰浴30 min； 3. 然后产物放置于42℃水浴锅热激90 s，结束后，迅速置于冰上，冰浴2-5 min； 4. 取900 μL无菌SOC或LB液体培养基加入EP管中，混匀后，将EP管置于摇床上，220 rpm，37℃培养1 h复苏细菌（也可置于37℃培养箱静置培养1 h）； 5. 根据实验需求，吸取不同体积已转化感受态细胞加到含有相应抗生素的LB固体培养基上，将细胞均匀涂布开，待液体完全吸收后将平板倒置于37℃培养箱，过夜培养。 阳性克隆鉴定 挑取平板的上生长出来的单克隆菌落进行菌落PCR鉴定、或经培养后提取质粒酶切或PCR鉴定、或将提取的质粒直接测序分析鉴定。 注意事项 1. 载体和目的片段务必进行凝胶纯化并电泳检测其质量和浓度，浓度低时可不加水，直接用其补足。 2. 试剂盒提供的载体与片段仅做试剂盒性能检测用，在5 μL体系中，载体与片段各加入1 μL。 3. 多片段重叠区域之间的Tm值需保持一致且>60℃。 4. 建议载体与插入片段摩尔比1:1~1:3；2~5片段连接时各片段之间摩尔比为1:1。 5. 当载体和插入片段总体积大于5 μL时，可将反应体系放大至20 μL。 6. 连接产物的体积不宜超过感受态细胞体积的1/10，否则会显著降低转化效率，可以等比例增加连接产物和感受态细胞体积（如20 μL连接体系转化200 μL感受态细胞）。 7. 2×In-Fusion Cloning Mix Plus建议使用时取出，用完后立即放回-20℃，解冻后可分装冻存以减少反复冻融次数。 8. 当使用电穿孔法转化时，反应产物需经柱式法或乙醇沉淀法等纯化DNA。 不同类型质粒构建实验流程简图 1. 重组质粒构建实验流程简图 A. PCR 扩增获得插入 DNA 片段： 在目的片段正/反向引物的 '端引入15-25 bp 线性化载体末端的同源序列（绿色和浅蓝色标示），PCR扩增目的片段，使得扩增产物5'和3'末端序列分别和线性化载体两末端序列完全一致。 B. 载体线性化： 限制性内切酶酶切或反向 PCR 获得线性化载体。 C. In-Fusion Cloning Plus: 将线性化载体和纯化回收后的插入片段按照比例混合，50℃反应15 min即可完成反应。 D. 转化感受态细胞： 反应产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，从平板上挑取生长出来的单克隆菌落进行 PCR、酶切或测序等实验筛选阳性克隆子。 2. 单点基因突变重组质粒构建实验流程简图 A. 两片段 PCR(PCR 扩增突变位点两端DNA片段)： 在基因突变位点设计互补引物（橙色标示），同时在突变基因两端设计引物引入 15-25 bp 线性化载体末端的同源序列（绿色和浅蓝色标示），使用不同引物对将突变基因分两片段分别 PCR 扩增获得带有同源序列的两个插入片段（分别包含基因突变位点）。 B. 载体线性化： 限制性内切酶酶切或反向PCR获得线性化载体。 C. In-Fusion Cloning Plus： 将线性化载体和纯化回收后的插入片段按照比例混合，50℃反应15 min即可完成反应。 D. 转化感受态细胞： 反应产物直接转化大肠杆菌感受态 细胞，从平板上挑取生长出来的单克隆菌落进行PCR、酶切或测序等实验筛选阳性克隆子。 3. 多片段插入重组质粒构建实验流程简图 A. 分别 PCR 扩增多片段： 扩增引物设计时在其 5'端添加同源序列（绿色、深蓝色、黄色、浅蓝色标示），使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有一段 15-25 bp 左右的同源序列，使用不同引物对分别PCR扩增DNA片段（橙色、红色和紫色标示）。 B. 载体线性化： 限制性内切酶...