动物组织/细胞线粒体分离试剂盒，适用于从动物组织、细胞中分离线粒体，分离的线粒体可用于线粒体基因表达水平和蛋白丰度检测等下游应用，使用此试剂盒能够有效分离线粒体且完整性好。 规格 动物组织/细胞线粒体分离试剂盒 G3750-50T 50T 产品简介 线粒体是所有真核细胞内重要的细胞器，不仅对维持细胞能量代谢和正常的功能活动起重要作用，还与细胞凋亡密切相关。线粒体功能障碍可导致严重的疾病，如癌症、不孕症、糖尿病、心脏病等。线粒体功能障碍还与衰老和神经退行性疾病有关，例如帕金森病和阿尔茨海默病。因此对线粒体进行分离，并对线粒体活性、mtDNA、mtRNA以及线粒体蛋白进行分析研究有着重要意义。 本试剂盒是一款专为从各种动物组织与细胞中高效分离线粒体而设计的。分离的线粒体可用于各种下游应用。 应用： 1. 显微镜观察线粒体形态 2. 线粒体膜电位检测 3. ATP产生能力检测 4. 呼吸链活性检测 5. 线粒体蛋白丰度（如：人源线粒体指标有ND1、ATP8、COX1、CYTB等） 6. 线粒体基因表达水平 7. 测序分析线粒体基因组和转录组的变异情况 特点： 1. 从动物组织或细胞中简单、快速分离完整性较好的线粒体 2. 可根据需要选择匀浆法（组织/细胞）或试剂法（细胞）进行分离线粒体 3. 试剂法处理细胞样本可实现高通量分离线粒体 4. 分离出的线粒体可用相应试剂进行裂解用于下游蛋白质与核酸分析 样本种类、样本量以及产量： 1. 60-100 mg动物组织可得到100 µg以上蛋白 2. 1-2×10 7 培养细胞可得到50 µg以上蛋白 储存与运输 冰袋 （wet ice） 运输；-20℃保存，有效期12个月。 组成 Component Number Component G3750-50T G3750-1 线粒体分离试剂A 100 mL G3750-2 线粒体分离试剂B 50 mL G3750-3 BSA Solution 1 mL G3750-4 线粒体储存液 10 mL 说明书 1份 使用前准备 1. 提前预冷离心机至4℃。 2. 自备玻璃匀浆器，使用前冰上预冷。 3. 如果分离线粒体后需要制备线粒体蛋白样品，提前向线粒体分离试剂A或B和线粒体储存液中加入终浓度为1 mM的PMSF （需自备，推荐G2008） 或其他蛋白酶抑制剂，加入蛋白酶抑制剂的试剂要现配现用。 操作流程图 操作步骤 组织或细胞匀浆： 1. 样本处理 1) 组织匀浆：称取60-100 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，用1 mL预冷的PBS或生理盐水冲洗2次，用剪刀剪至1-3 mm 3 的碎块后加入1 mL预冷的PBS或生理盐水，1,000 g，4℃离心3 min，用移液器吸除上清； 2) 培养细胞匀浆：收集1-2×10 7 个细胞，加入1 mL预冷的PBS，1,000 g，4℃离心5 min，弃上清，重复一次。 2. 加入1 mL线粒体分离试剂A （骨骼肌、心脏等硬组织样本需加入20 µL的 BSA Solution ） ，使用移液器轻轻吹打重悬样本； 3. 将样品转移到预冷的小容量玻璃匀浆器中，冰浴上下研磨10-30次 （细胞样本研磨次数为25-50次） ； 4. 将匀浆液转移到1.5 mL离心管中，1,000 g，4℃离心10 min （此时的沉淀包含细胞核、细胞碎片、未破碎的细胞等） ； 5. 对于组织样品，将上清转移至新的1.5 mL离心管，1,000 g，4℃再次离心10 min，细胞样本可直接进行下一步； 6. 将上清转移至新的1.5 mL离心管中，12,000 g，4℃离心10 min，弃上清，沉淀即为线粒体（ 如果后续需要对胞质蛋白进行分析，保存此步上清液） ； 7. 向线粒体沉淀中加入500 µL线粒体分离试剂A，使用移液器轻轻吹打重悬线粒体沉淀，12,000 g，4℃离心10 min，尽可能除去上清； 8. 重复步骤7； 9. 加入50-100 μL线粒体储存液，使用移液器轻轻吹打重悬线粒体沉淀，立即使用或-80℃保存。 培养细胞试剂法裂解： 1. 收集1-2×10 7 个细胞，加入1 mL预冷的PBS，1,000 g，4℃离心5 min，弃上清，重复一次； 2. 加入1 mL预冷的线粒体分离试剂B，使用移液器轻轻反复吹打25-50次或低频超声1-3 min破碎细胞，冰上孵育10 min； 3. 1,000 g，4℃离心10 min （此时的沉淀包含细胞核、细胞碎片、未破碎的细胞等，请勿丢弃，进行二次破膜） ； 4. 将上清转移至新的1.5 mL离心管中，12,000 g，4℃离心10 min，弃上清 ， 沉淀即为线粒体（ 如果后续需要对胞质蛋白进行分析，保存此步上清液） ； 5. 将步骤3得到的沉淀重复步骤2-4操作进行二次破膜收集线粒体沉淀； 6. 向两管线粒体沉淀中各加入250 µL线粒体分离试剂A，使用移液器轻轻地重悬线粒体沉淀并合并为一管，12,000 g，4℃离心10 min，弃上清； 7. 加入500 µL线粒体分离试剂A，12,000 g，4℃离心10 min，弃上清； 8. 加入50-100 μL线粒体储存液，使用移液器轻轻地重悬线粒体沉淀，立即使用或-80℃保存。 注意事项 1. 请勿使用冻存组织或细胞。 2. 操作前将所有试剂完全解冻后置于冰上。 3. 分离线粒体的所有步骤需在冰上进行，所用溶液及器具需提前预冷。 4. 肌肉或心脏组织分离线粒体时可适当增加研磨次数。 5. 如选用细胞超声破碎仪，运行时间可根据样本类型与样本量进行调整。 6. 如需观察细胞膜破碎情况，可取少量细胞液，与台盼蓝染色液按照1:1比例混合后进行镜检，当≥80%细胞为蓝色时，可进行下面实验。 7. 冻存后的线粒体样品不推荐用于活性检测，但可以用于线粒体蛋白或核酸的相关检测。 8. 培养细胞试剂法分离线粒体可以进行高通量操作，线粒体得率可能低于匀浆法。 9. 如果处理大于100 mg组织或2×10 7 个细胞，需按比例增加各试剂用量。 实验案例 1. 使用G3750-动物组织/细胞线粒体分离试剂盒分别从1×10 7 HEK293T细胞、60 mg小鼠肌肉组织、100 mg小鼠脑、100 mg小鼠肾脏中分离线粒体后拍电镜，结果显示（图1）：G3750分离得到的线粒体完整性较好。 图1：线粒体电镜图。 2. 使用G3750-动物组织/细胞线粒体分离试剂盒分离100 mg小鼠肝组织线粒体后提取线粒体蛋白，选择VDAC1、COXIV、Cytochrome c作为线粒体蛋白特异指标，GAPDH作为胞质蛋白特异指标，进行WB分析，结果显示（图2）：G3750分离得到的线粒体纯度较好。 图2：线粒体蛋白与胞质蛋白WB分析图。 3. 使用G3750-动物组织/细胞线粒体分离试剂盒从2×10 7 个 Raw264.7细胞分离线粒体，分别测试匀浆裂解与试剂法裂解，取匀浆后产物、1,000 g离心沉淀（包含细胞核、细胞碎片、未破碎的细胞等）、12,000 g收集线粒体沉淀与上清分别做流式分析，结果显示（图3）：G3750试剂盒的匀浆裂解与试剂法裂解系列均可得...