细胞浆、细胞膜与细胞核蛋白分步提取试剂盒，可以在90min内分离提取细胞和新鲜组织中，高纯度的细胞浆蛋白，膜蛋白、核蛋白。后续通过WB，EMSA等实验，研究不同组分在细胞中的定位。 搭配赛维尔研磨仪 低温型（ SWE-FP ）+高速低温离心机（ SLX-1024F ），以及Cocktail（ G2006-250UL ）+PMSF（ G2008-1ML ）+磷酸酶抑制剂（ G2007-1ML ）蛋白酶抑制剂，蛋白提取效果更好，WB实验结果好 规格 细胞浆、细胞膜与细胞核蛋白分步提取试剂盒 G3742-50T 50 T 产品简介 本产品适用于细胞浆蛋白，膜蛋白与核蛋白的分步分离提取，可用于研究不同组分在细胞中的定位。分离蛋白可用于后续SDS-PAGE，WB，EMSA等实验。 本试剂盒提供了一种简单，方便，快速的浆蛋白，膜蛋白及核蛋白分步提取方法。能够在90min以内完成提取。可使用同一样本分别提取获得不同组分蛋白。 本产品使用特异性浆蛋白抽提试剂裂解细胞，离心即可获得细胞浆蛋白。获得的沉淀使用膜蛋白抽提试剂溶解获得所有膜组分蛋白（包含细胞膜、内质网、线粒体等细胞器的膜蛋白）；最后使用核蛋白抽提试剂A和B充分抽提细胞核蛋白。 储存与运输 干冰（dry ice）运输； -20℃保存， 有效期12个月 。 组成 Component number Component G3742-50T G3742-1 细胞浆蛋白抽提试剂 15 mL G3742-2 细胞膜蛋白抽提试剂 10 mL G3742-3 细胞核蛋白抽提试剂A 5 mL G3742-4 细胞核蛋白抽提试剂B 250 μL 说明书 1份 操作 说明 1. 对于 细胞 ： 1.1. 使用前将本产品室温解冻后冰浴放置； 1.2. 根据使用体积配制工作液： 1.2.1. 细胞浆蛋白抽提工作液：在细胞浆蛋白抽提试剂（G3742-1）中添加 50×Cocktail （ G2006-250UL ) 至1 × ，PMSF（ G2008-1ML ）至1mM，临用前添加避免失效。 1.2.2. 细胞膜蛋白抽提工作液：在细胞膜蛋白抽提试剂（G3742-2）中加入 50×Cocktail （ G2006-250UL ) 至1 × ，PMSF至1mM（ G2008-1ML ），临用前添加避免失效。 1.2.3. 细胞核蛋白抽提工作液：在细胞核蛋白抽提试剂A（G3742-3）中加入 50×Cocktail （ G2006-250UL ) 至1 × ，PMSF至1mM（ G2008-1ML ），2%体积的细胞核蛋白抽提试剂B（G3742-4），临用前添加避免失效。 1.3. 细胞裂解：根据细胞沉淀量添加细胞浆蛋白抽提工作液，重悬细胞，于4℃裂解10min。裂解过程中涡旋2-3次。裂解液使用体积根据细胞沉淀体积确定，推荐10μl细胞沉淀加入100μl裂解液。（例如10 6 总量的Hela细胞沉淀量约为10μl，加入细胞浆蛋白抽提工作液100μl进行裂解。） 1.4. 2000g，4℃条件下离心5min。其中上清作后续浆蛋白提取，沉淀作膜蛋白及核蛋白提取。 1.5. 将1.4上清在12000g，4℃条件下离心5min，收集上清即为胞浆蛋白。 1.6. 膜蛋白提取：使用1ml预冷PBS对1.4步骤中沉淀进行涡旋重悬清洗，洗涤后于2000g，4℃条件下离心5min，弃去上清，尽量吸尽液体以防止蛋白污染。每管加入200μl 细胞膜蛋白抽提工作液，重悬细胞，于4℃孵育10min。孵育过程中涡旋2-3次。 1.7. 2000g，4℃条件下离心5min，收集上清作膜蛋白提取用，沉淀做核蛋白提取用。 1.8. 将1.7步骤中上清在12000g，4℃条件下离心5min，收集上清即为胞膜蛋白。 1.9. 核蛋白提取：使用1ml预冷PBS对1.7步骤中沉淀进行涡旋清洗，洗涤后于2000g，4℃条件下离心5min，弃去上清，尽量吸尽液体以防止蛋白污染。每管加入50-100μl 细胞核蛋白抽提工作液，重悬细胞，于4℃裂解30min，裂解过程中每3min涡旋一次。 1.10. 12000g，4℃条件下离心5min，收集上清即为细胞核蛋白。 2. 对于新鲜或冻存组织 2.1. 使用前将本产品室温解冻后冰浴放置。 2.2. 根据使用体积配制工作液： 2.2.1. 细胞浆蛋白抽提工作液：在使用前加入Cocktail，PMSF至1mM，临用前添加避免失效。 2.2.2. 细胞膜蛋白抽提工作液：在使用前加入Cocktail，PMSF至1mM，临用前添加避免失效。 2.2.3. 细胞核蛋白抽提工作液：使用前在细胞核蛋白抽提试剂A中加入Cocktail，PMSF至1mM及2%体积的细胞核蛋白抽提试剂B，临用前添加避免失效。 2.3. 把组织尽可能切成细小的碎片 ， 使用预冷PBS清洗1-2次。 每 5 0mg组织加入 1 mL 细胞浆蛋白抽提工作液，使用预冷 玻璃匀浆器 或低温组织研磨仪 充分匀浆。 玻璃匀浆器研磨30-60次，研磨仪设置参数60hz，30s，2次。研磨次数及研磨仪参数可根据组织类型进行调整。 2.4. 2000g，4℃条件下离心5min。其中上清作后续浆蛋白提取，沉淀作膜蛋白及核蛋白提取。 2.5. 将上述上清在12000g，4℃条件下离心5min，收集上清，即为胞浆蛋白。 2.6. 膜蛋白提取：使用预冷PBS对2.4沉淀进行涡旋重悬清洗，洗涤后于2000g，4℃条件下离心5min，弃去上清，尽量吸尽液体以防止蛋白污染。每管加入200μl 细胞膜蛋白抽提工作液，重悬组织沉淀，于4℃孵育10min。孵育过程中涡旋2-3次。 2.7. 2000g，4℃条件下离心5min，收集上清作膜蛋白提取用，沉淀做核蛋白提取用。 2.8. 将上述上清在12000g，4℃条件下离心5min，收集上清即为胞膜蛋白。 2.9. 核蛋白提取：使用预冷PBS对2.7沉淀进行涡旋清洗，洗涤后于2000g，4℃条件下离心5min，弃去上清，尽量吸尽液体以防止蛋白污染。根据沉淀体积在每管加入50-100μl 细胞核蛋白抽提工作液，重悬组织沉淀，于4℃裂解30min，裂解过程中每3min涡旋一次。 2.10. 12000g，4℃条件下离心5min，收集上清即为细胞核蛋白。 注意事项 1. 试剂-20℃保存，使用前室温解冻后马上冰浴预冷。 2. 本实验全程需在低温环境下进行。 3. 膜蛋白在高温煮沸时，容易发生聚集现象，形成二聚体或多聚体 。 对于跨膜蛋白，参考的变性温度是50-70℃ 15min或者 37℃ 30min 。 4. 根据实验需求可在蛋白提取试剂中加入磷酸酶抑制剂。 5. 膜蛋白及核蛋白抽提时尽量重悬沉淀以获得更好的抽提效果。 6. PMSF临用前添加，避免失效。 7. 本产品适用于新鲜或冻存组织，但冻存组织的分离提取效果会变差。 8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ （产品包装升级中，以实物为准。 ）