产品信息

产品简介

SweFast Cut EagI来源于大肠杆菌重组表达的携带有克隆自团肠杆菌Enterobacter agglomerans（R. Morgan）的EagI基因，可在5~15 min内精确完成DNA切割的快速限制性内切酶，适用于快速切割质粒DNA、PCR产物、基因组DNA等。

产品组成

酶活定义：在37°C条件下，20 μL反应体系中，1 μL酶能够在15 min内完全消化1 μg pXba DNA所需的酶。

识别位点：5'-C↓GGCCG-3'

    3'-GCCGG↑C-5'

反应条件：1×SweFast Cut Buffer；最适37°C孵育。

存储液组成为：10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, 200 µg/ml BSA, pH 7.5 @ 25°C

10×SweFast Cut Buffer组成：500 mM Potassium Acetate, 200 mM Tris Acetate, 100 mM Magnesium Acetate, 1000 µg/ml BSA, pH 7.9 @ 25°C

热失活条件：65°C孵育20 min。

储存与运输

干冰运输；-20°C保存，有效期2年, 可以适当分装后-80°C冻存延长保存时间。

注意事项

1. 3 h 孵育未表现星号活性，延时酶切可能出现星号活性。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

质量控制

1. 功能活性检测：最适反应温度下20 μL反应体系中，1 μL酶能够在15 min内完全消化1 μg pXba DNA。

2. 超长时间孵育检测：最适反应温度下，将1 μL酶与1 μg λDNA共孵育3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解，但延长孵育时间可能出现星号活性。

3. 酶切-连接-再酶切检测：最适反应温度下，使用1 μL酶消化底物，回收酶切产物，在16°C下使用适量T4 DNA连接酶可以将酶切产物重新连接，将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。

4. 非特异性内切酶活性检测：最适反应温度下，将1 μL酶与1 μg超螺旋质粒DNA共同孵育4 h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒 DNA仍然处于超螺旋状态。

5. 蓝白斑检测：将含有单一lacZα基因的载体以1 μL 酶消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、IPTG和X-gal的LB培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误（即DNA末端切口不完整）的产物将得到白色菌落。对于SweFast Cut系列限制酶而言，白色菌落比例应小于1%。

使用说明

1. DNA 快速酶单酶切推荐体系

1) 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：^a本体系适用于经过纯化的PCR产物酶切；

2) 使用前请将10×SweFast Cut Buffer混匀；

3) 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心；

4) 37℃温育5-15 min（质粒），或15~30 min（PCR产物），或30~60 min（基因组DNA），不同的DNA由于其结构不同会导致酶切效果不同，因此可根据酶切效果调整反应时间。

5) 酶切不完全或者酶切2 μg以上的DNA时，可以适当增加酶量，但总酶量不得超过总反应体系的1/10。

6) 65℃温育20 min即可使酶失活，停止反应（可选），对于不能热失活的酶，我们建议进行柱纯化或琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。

7) 如果总反应体系大于20 μL，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。

2. 双酶切或多酶切推荐体系

1) 每种快速内切酶的用量为1 μL，并根据需要适当扩大反应体系；

2) 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10, 反应体系中甘油的浓度应<5%以避免星号活性。例如：50 μL反应体系中总酶量不超过5 μL。

3) 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，热失活第一种酶后再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。

4) 在推荐反应温度、时间下孵育，双酶切反应不建议孵育过夜。

甲基化修饰影响

Dam：甲基化不影响；

Dcm：甲基化不影响；

CpG：甲基化阻断酶切。

同裂酶

BseX3I, BstZI, EclXI, Eco52I, XmaIII+

【注】：同裂酶对于不同的甲基化修饰也许具有不同敏感性。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）