本产品是一种以Rhod-2 AM为荧光探针，快速灵敏地检测线粒体内钙离子(Ca2+)变化的试剂盒。荧光显微镜下观察进入细胞呈现点状染色模式,与钙离子结合后其最大激发波长为552 nm，最大发射波长为581 nm。可根据实验方案选择不同规格赛维尔细胞培养板进行检测实验。

产品信息

产品描述

线粒体钙离子检测试剂盒（Rhod-2 AM荧光法），也称线粒体钙流检测试剂盒，是一种以Rhod-2 AM为荧光探针，快速灵敏地检测线粒体内钙离子(Ca²⁺)变化的试剂盒。Rhod-2 AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，Rhod-2 AM可透过细胞膜，通过其乳糖酶切割产生具有不透过膜的Rhod-2，从而滞留在细胞内。以罗丹明结构为基础的Rhod-2 AM带正电荷，以电位驱动的方式吸收聚集在线粒体，荧光显微镜下观察进入细胞呈现点状染色模式,与钙离子结合后其最大激发波长为552 nm，最大发射波长为581 nm。本试剂盒以荧光显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测，以96孔板使用体积100 μL为例，可以使用200次。

储存与运输

干冰(Dry ice)运输；-80℃保存；6个月有效。

组成

操作步骤

一、 溶液准备

1. 自备含钙镁HBSS缓冲液（推荐使用G4204，如无特殊说明，后续洗涤等步骤均使用含钙镁HBSS）

2. 1×Rhod-2 AM染色工作液配制：取1 μL Rhod-2 AM（1000×）和1 μL CaCl₂(1000×)于1 mL染料稀释液中，混合均匀。（Rhod-2 AM推荐使用浓度0.8×-1.25×，可在此范围内进行调整。）

3. 1×Ionomycin 阳性对照液配制（可选）：取1 μL Ionomycin (1000×)于1 mL HBSS缓冲液中混合均匀。（Ionomycin 推荐使用浓度0.5×-2×，可在此范围内进行调整。）

二、 贴壁细胞染色

1. 将细胞接种于培养皿、多孔细胞培养板或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。

2. 吸出培养液，用HBSS缓冲液洗涤2-3次。

3. 染色液添加：加入适量体积的1×Rhod-2 AM染色工作液到正常细胞和实验组细胞中，一般96孔板每孔体积为100 μL，24孔板每孔体积为250 μL，12孔板每孔体积为500 μL，6孔板每孔体积为1 mL。

4. 室温避光孵育20 min（不同细胞孵育时间存在差异，可在15-45 min范围内调整）。

5. 孵育结束后吸出液体，用HBSS缓冲液洗涤2-3次后，加入适量HBSS缓冲液覆盖.

6. 阳性对照组（可选）：加入适量体积的1×Ionomycin阳性对照液到正常细胞中，室温孵育2-3 min。

7. 吸出液体，用HBSS缓冲液覆盖，避免孵育太久导致通透孔打开。

8. 可用荧光显微镜的RFP通道观察，也可用酶标仪Ex/Em：552/581 nm检测。如果需要用流式细胞仪检测，需要在染色前将细胞重悬后再进行后续实验，但胰酶消化可能影响细胞膜的通透性，从而影响钙离子内流，导致差异性改变。

三、 悬浮细胞染色

1. 细胞按实验设计进行一定处理后，计数。

2. 取适当细胞1000 g室温离心5 min，弃上清，用HBSS缓冲液洗涤2-3次。

3. 染色液添加：加入适量体积的1×Rhod-2 AM染色工作液到正常细胞和实验组细胞中（此时细胞密度约为1×10⁶/mL）。

4. 室温避光孵育20 min（不同细胞孵育时间存在差异，可在15-45 min范围内调整）。

5. 孵育结束后，1000 g室温离心5 min，吸除上清液，用HBSS缓冲液重悬，重复2-3次。

6. 阳性对照组（可选）：加入适量体积的1×Ionomycin阳性对照液到正常细胞中，室温孵育2-3 min。

7. 1000 g室温离心5 min，吸除上清液，加入HBSS缓冲液重悬。

8. 可用荧光显微镜的RFP通道观察，也可用酶标仪Ex/Em：552/581 nm检测和流式细胞仪检测。

注意事项

1. 如每次使用的Rhod-2 AM探针较少，请视情况分装，尽量避免Rhod-2 AM探针反复冻融，-80℃避光保存。

2. Rhod-2 AM工作液应现配现用，不能提前配制，否则将影响染色效果。

3. 阳性对照样品在20 min内尽快检测，否则荧光会减弱，或细胞内点状结构会消失。

4. 如果染色后不能观测到细胞内的点状结构，可以尝试低于室温温度染色。

5. 本产品对光敏感，操作过程尽量避免强光接触。

6. 本产品为检测活细胞试剂盒，染色前后不可固定。

7. 操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！