产品信息

产品描述

本试剂盒是一种以DHE（Dihydroethidium）为荧光探针，快速灵敏地检测组织内超氧阴离子活性氧的试剂盒。DHE探针在组织中活性氧存在的条件下，被氧化生成溴化乙锭，溴化乙锭可以与细胞内核酸结合，产生红色荧光，红色荧光强度与组织内活性氧水平成正比，可间接判断组织内活性氧的水平，同时也可用于细胞、血清样本的活性氧检测。DHE本身为蓝色荧光，Ex为355 nm，Em为420 nm；当DHE脱氢和核酸结合后显示为红色荧光，Ex为520 nm，Em为605 nm。细胞样本染色后可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测系统进行检测；组织样本需裂解后，使用荧光酶标仪进行检测。

储存与运输

冰袋(wet ice)运输；-20℃保存；6个月有效。

组成

操作步骤

一、 组织样本检测

1. 100×DHE染色液配制：取2 μLDHE探针（500×）与8 μL PBS缓冲液充分混匀，配制成100×DHE染色液备用。

2. 组织样本处理：

a. 取新鲜的组织样本，用PBS洗涤干净。

b. 50 mg组织中加入450 μL匀浆缓冲液（可按比例增减），充分匀浆。

c. 10000 g，4℃离心10 min，弃沉淀，取上清（建议立即检测，或-80℃保存）。

3. 样本检测

a. 在黑色96孔板（推荐货号LTP-96-BY）中加入90 μL匀浆缓冲液和10 μL组织匀浆上清。

b. 加入1 μL 100×DHE染色液，混合均匀。

c. 37℃避光孵育20 min，酶标仪设置激发波长520 nm，发射波长设置605 nm检测。

d. 数据分析：荧光强度（RFU)/蛋白质量（蛋白浓度*加入样本的体积），其比值表示组织样本活性氧强度。

二、 血清样本检测

1. 100×DHE染色液配制：取2 μLDHE探针（500×）与8 μL PBS缓冲液充分混匀，配制成100×DHE染色液备用。

2. 样本检测

a. 在黑色96孔板（推荐货号LTP-96-BY）中加入50 μL匀浆缓冲液和50 μL血清。

b. 加入1 μL 100×DHE染色液，混合均匀。

c. 37℃避光孵育20 min，酶标仪设置激发波长520 nm，发射波长设置605 nm检测。

d. 数据分析：以荧光强度（RFU)/加入样本的体积的比值，表示血清活性氧强度。

三、 活细胞检测

1. DHE染色工作液配制：取2 μL DHE探针（500×）与1 mL PBS充分混匀，配制成1×DHE染色工作液备用。

2. 细胞染色（以下为贴壁细胞6孔板方案，悬浮细胞换液需要离心操作）

a. 正常或处理过后的细胞，用PBS洗涤2-3次。

b. 加入1 mL 1×DHE染色工作液，37℃避光孵育30 min（不同细胞孵育时间存在差异，可在10-60 min范围内调整）。

c. 用PBS洗涤细胞2-3次。

d. 用荧光显微镜可直接观察，选择DsRed通道即可激发；若用酶标仪检测，推荐使用黑底不透明发光板（货号LTP-96-BY）检测，设置激发波长520 nm，发射波长605 nm；流式细胞仪检测，选择PE通道。

注意事项

1. 如每次使用的DHE探针较少，请视情况分装，尽量避免DHE探针反复冻融，-20℃或-80℃避光保存。

2. 本产品对光敏感，操作过程尽量避免强光接触。

3. 尽量保持样本新鲜，组织匀浆后短期保存于-80℃的样本。

4. 冰冻细胞样本，可采取组织样本的方式，匀浆后进行检测。

5. 样本检测时，如果结果与预期存在较大差别，可以将组织匀浆液和血清稀释做标曲，在线性范围内选择合适的稀释度进行检测。

6. 操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！