产品信息

产品简介

细菌/酵母活力染色试剂盒（DMAO/PI荧光法）是一款利用DMAO（绿色荧光）和碘化丙啶（PI，红色荧光）核酸染料进行活、死细菌染色的试剂盒，可使用酶标仪，流式细胞仪以及荧光显微镜等荧光分析仪器进行分析。适用于各种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，溶壁微球菌等。另，本试剂盒也可用于酵母菌的活力染色。

该试剂盒含有DMAO和碘化丙啶（PI）两种荧光染料，其中DMAO是一种既可染色膜完整的细菌，也可染色膜受损细菌的绿色荧光染料，且该染料特别稳定，在室温下进行常规的操作和储存，也不会降解；碘化丙啶（PI）是一种红色核酸荧光染料，仅染色膜受损的死细菌。当细菌悬液中同时加入两种染料时，适当调整DMAO和碘化丙啶（PI）的比例，可使具有完整膜结构的细菌呈绿色荧光，而具有受损膜结构的细菌呈红色荧光。两者染料与核酸结合后最大激发和发射波长分别是496/528 nm（DMAO）和535/615 nm（PI）。

细菌的生存活力，指在适合的培养物中细菌的繁殖能力。在一些条件下膜受损的细菌依旧可以繁殖，但在检测过程中会被判定为死细菌；而一些膜结构完整的细菌虽被判定为活细菌，却没有繁殖力。因此，如果该检测与生长测定之间存在较大差距时，应考虑以上原因。

按推荐的用法用量，如果用流式细胞仪检测：每500 μL菌液加入5 μL 100×染料混合液（2.5 μL DMAO +1 μL PI+6.5 μL 0.85% NaCl），可做40次独立实验。如果采用荧光酶标仪检测或荧光显微镜检测：每100 μL菌液加入1 μL 100×染料混合液（2.5 μL DMAO +1 μL PI+6.5 μL 0.85% NaCl），可做200次独立实验。

储存与运输

冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，12个月有效。

组成

操作步骤

【注意】：本试剂盒进行细菌染色，核酸和其它培养基成分可能会以不可预估的方式与DMAO和PI结合，导致染色结果与预期差别较大，故务必去除培养基残留，同时磷酸盐缓冲液也可能降低染色效率，推荐选用0.85% Nacl溶液。在实验过程中，如果发现绿光染色效率过低，或者红光过高，可以通过适量提高绿色染料的体积或者降低红色染料的体积调整荧光强度达到预期效果。

一、活细菌/死细菌制备（以大肠杆菌为例，细菌活死比例参考，选做）

(1) 在LB液体培养基中将大肠杆菌培养至晚期对数期。

(2) 用EP管将菌液分成2份，将其中一份8000 g条件下离心10 min（另一份室温放置用来制备活细菌）。

(3) 去除上清液，加入适量的0.85% Nacl重悬细菌，再加入适量无水乙醇使乙醇的终浓度为70%乙醇，充分混匀，室温下孵育1 h，每15 min混合一次，用于制备死细菌。

(4) 将2份菌液在8000g条件下离心10 min。

(5) 去除上清，在两种样品中加入适量的0.85% NaCl重悬细菌，并如步骤4再次离心，并重悬。

(6) 使用分光光度计测定两种菌悬液在670 nm处的吸光值（OD670）。

(7) 调整两种菌悬液（活的和死亡的）的光密度使其OD670在0.1-0.5之间。

(8) 如下所示混合两种菌悬液以获得所需的活细胞：死细胞比率。

二、荧光显微镜操作步骤

(1) 细菌8000 g条件下离心10 min，去除上清，加入适量的0.85% NaCl重悬细菌，重复离心一次，重悬于适量0.85% NaCl。

(2) 调整细菌光密度，如大肠杆菌，OD670在0.1-0.5之间。

(3) 将2.5体积的DMAO和1体积的PI在微量离心管中混合，充分混合后加入6.5体积的0.85% NaCl溶液以得到100×染料混合液。

(4) 每100 μL菌悬液，加1 μL的100×染料混合液。

(5) 充分混合，室温避光孵育15 min。

(6) 取5 μL染色后的菌悬液滴在载玻片上，再用18 mm方形盖玻片轻轻盖上。

(7) 在荧光显微镜下观察。活细菌（绿色荧光）和死细菌（红色荧光）可分别用FITC和Tx-Red通道观察拍照。

三、荧光酶标仪操作步骤

(1) 细菌8000 g条件下离心10 min，去除上清，加入适量的0.85% NaCl重悬细菌，重复离心一次，重悬于适量0.85% NaCl。

(2) 调整细菌光密度，如大肠杆菌，OD670在0.1-0.5之间。

(3) 将2.5体积的DMAO和1体积的PI在微量离心管中混合，加入6.5体积的0.85% NaCl溶液，充分混合以得到100×染料混合液。

(4) 取100 μL细菌悬液到黑色平底96孔板，每100 μL菌液加入1 μL染料混合液。

(5) 充分混合，室温避光孵育15 min。

(6) 荧光测定和数据分析

1) 以~496nm为激发波长，~528nm为发射波长（emission 1，绿色）来测定每孔荧光

2) 以~535nm为激发波长，~615nm为发射波长（emission 2，红色）来测定每孔荧光；

3) 通过测定两种发射波长下的荧光强光，并计算荧光比值=emission1/emission2;

4) 以大肠杆菌悬液内活细胞的比例为横坐标，以emission1/emission2为纵坐标，制线性图。

四、流式细胞仪操作步骤

(1) 细菌8000 g条件下离心10 min，去除上清，加入适量的0.85% NaCl重悬细菌，重复离心一次，重悬于适量0.85% NaCl。

(2) 调整细菌光密度，如大肠杆菌，OD670在0.1-0.5之间。

(3) 将2.5体积的DMAO和1体积的PI在微量离心管中混合，加入6.5体积的0.85% NaCl溶液，充分混合以得到100×染料混合液。

(4) 每500 μL菌液加入5 μL染料混合液。

(5) 充分混合，室温避光孵育15 min。

(6) 流式分析仪分析，使用FITC通道检测DMAO(绿光，活菌)，使用PE/PC5.5通道检测PI（红光，死菌）。

注意事项

1. 由于DMAO和碘化丙啶（PI）组分较少，务必开盖前先低速离心。

2. 首次使用后可将染料小量分装保存，避免反复冻融和污染，若使用较频繁，可暂时4℃保存半年左右。

3. DMAO和PI分别为400×，1000×的储存液，经过优化对大多数细菌都适用，但为了获得更满意的结果，对于不同类型的细菌请自行进行一定的浓度摸索，DMAO和PI的使用终浓度一般为0.5-2×，最优先的推荐终浓度为1×。

4. 大肠杆菌建议光密度OD670为0.1-0.5，枯草芽孢杆菌建议光密度OD670为0.01-0.3，溶壁微球菌建议光密度OD670为0.03-0.3，酵母菌建议光密度OD670为0.1-0.6。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）