产品信息

产品描述

DiI，又称 DiIC18(3)，中文全称1,1`-双十八烷基-3,3,3`,3`-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐，分子量933.87，是一类具有亲脂性的长链二烷基碳菁类染料荧光染料，常用于标记细胞膜以及其他脂溶性生物结构。DiI进入细胞膜后可以侧向扩散，逐渐使整个细胞膜被染色。DiI在进入细胞膜之前荧光较弱，当与细胞结合后荧光强度会大大增强，被激发后可以发出橙红色荧光，并可以用标准的TRITC滤光片检测。Dil最大激发波长为550 nm，最大发射波长为564 nm。根据DiI的特性，其可以用于活细胞以及固定细胞的成像检测。此外DiI探针一般不影响细胞的生存能力，故可正向或逆向的标记细胞或某些物质（外泌体）用作示踪检测。

本产品Dil细胞膜红色荧光染色试剂盒，包含Dil荧光探针及优化的染色缓冲液，使细胞膜染色更加快速、荧光更加明亮稳定、效果更好。

储存与运输

干冰运输；-20℃避光保存，探针避免反复冻融，有效期至少6个月。

试剂盒组成

操作步骤

1. DiI染色工作液配制：

1.1. 将DiI细胞膜红色荧光探针与DiI细胞膜标记染色缓冲液以1:250比例混合稀释，配制成DiI染色工作液（现配现用）。注意：DiI探针稀释比可根据具体情况在1:250-1:500进行调整，以获得最佳染色效果。

2. 悬浮活细胞染色：

2.1. 收集悬浮细胞，以500-1000 g室温离心3-5 min，去除细胞上清。

2.2. 使用DiI染色工作液重悬细胞，使细胞密度在1-2×10⁶个/mL。

2.3. 置于37℃避光孵育5-20 min，建议根据具体细胞调整染色时间，以获得最佳染色效果。

2.4. 孵育结束后，500-1000 g室温离心3-5 min，吸除DiI染色工作液。

2.5. 用37℃预热的PBS或细胞培养基重悬细胞，500-1000 g离心3-5 min，去除上清。

2.6. 重复2.5步骤一次。

2.7. 流式细胞仪上机检测，或将细胞转移至多孔板、细胞培养皿或者载玻片上，在荧光显微镜下观察。Dil最大激发波长550 nm，最大发射波长564 nm。

3. 贴壁活细胞染色（6孔板为例）：

3.1. 将细胞提前以一定密度种植于6孔板中。

3.2. 吸除细胞培养基，用PBS（G4202）洗涤细胞2次。加入1 mL DiI染色工作液（其他规格孔板，视情况调整，保证染料覆盖细胞）。

3.3. 置于37℃避光孵育5-20 min，吸除DiI染色工作液。建议根据具体细胞调整染色时间，以获得最佳染色效果。

3.4. 用37℃预热的PBS或细胞培养基，洗涤细胞1-2次。

3.5. 加入37℃预热的PBS或细胞培养基，荧光显微镜下观察。Dil最大激发波长550 nm，最大发射波长564 nm。

4. 固定的贴壁细胞染色：

4.1. 样本前处理：

对于细胞：去除细胞培养基，PBS洗涤1-2次。加入4%多聚甲醛固定液（G1101），室温固定10 min。吸除固定液，用PBS洗涤2-3次。

4.2. 加入0.1-0.5% Triton-100（PBS配制）处理细胞，室温通透10 min；吸除通透液，用PBS洗涤2-3次。

4.3. （可选，免疫荧光标记）按照免疫荧光染色的方法进行抗体的孵育或其他染料进行染色。注意。抗体孵育过程中的封闭液、抗体稀释液、洗涤液等不能含有去垢剂。

4.4. 加入适量体积的DiI染色工作液覆盖细胞，37℃避光孵育5-20 min，吸除DiI染色工作液。建议根据具体细胞样本调整染色时间，以获得最佳染色效果。

4.5. 细胞经PBS洗涤2-3次，然后置于荧光显微镜观察（细胞需以适量PBS覆盖）。Dil最大激发波长550 nm，最大发射波长564 nm。

5. 外泌体荧光标记：

5.1. 取至少1×10⁹颗粒数外泌体（约50-100 μg蛋白量），加入1 mLPBS或染色缓冲液重悬。

5.2. 将DiI细胞膜红色荧光探针与染色缓冲液以1：25比例混合稀释，配制成10×DiI染色液（现配现用），与外泌体溶液1：10混合，将样品置于37℃避光孵育30 min。

5.3. 用10倍体积PBS稀释样品体积（可选）。

5.4. 按照超速离心或者尺寸排阻法，再一次提取外泌体，以去除多余的染料。

5.5. 收集的外泌体沉淀，用PBS重悬，得到DiI标记的外泌体。可用于相应的后续实验，如细胞摄取。

注意事项

1. 荧光染料均存在淬灭问题，请注意避光以减缓荧光猝灭。

2. 探针亲脂性的特点，实验过程中请避免使用含有甘油或其它有机物的试剂，否则会影响染色效果。

3. 当需要固定操作时，样品宜在4%多聚甲醛中进行固定，其他不适当的固定液会导致荧光背景高。

4. 由于细胞间敏感性和实验目的的不同，探针的最佳稀释比和最佳孵育时间需根据实际情况适当调整。

5. 为了您的健康和安全，操作时请穿好实验服、戴好手套。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！