用可根据绿色荧光的强弱来判断线粒体膜通透性，常用于评估细胞凋亡或坏死过程中线粒体功能的变化该试剂盒可以搭配赛维尔线粒体荧光探针，通过标记线粒体位置和形态，清晰地显示线粒体的状态。

还可根据实验方案选择不同规格赛维尔细胞培养板进行检测实验。

产品信息

产品描述

线粒体在细胞凋亡和坏死中起关键作用。线粒体通透性转换孔（MPTP）由内膜和外膜成分构成，在细胞死亡时参与线粒体成分释放。在正常细胞中，线粒体内膜维持膜电位梯度，保证细胞呼吸和能量供应，MPTP在张开和闭合间切换。细胞凋亡或死亡时，MPTP持续开放，改变线粒体通透性，导致Ca²⁺过载、氧化型谷胱甘肽增加、活性氧水平上升，最终使细胞色素C释放，线粒体膜电位降低甚至消失。

本试剂盒使用荧光探针钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein acetoxymethyl ester，即Calcein AM)和CoCl₂试剂对线粒体通透孔进行检测。Calcein AM是无色无荧光的酯酶底物，进入细胞后被酯酶水解为极性荧光染料Calcein，使细胞质和线粒体呈强绿色荧光。CoCl₂可淬灭Calcein的荧光。正常生理条件下，MPTP关闭，CoCl₂无法进入线粒体，经CoCl₂处理后，仅线粒体保留绿色荧光。作为对照，用Ionomycin等处理细胞，诱导MPTP开放，使Calcein释放与钴离子结合淬灭，线粒体绿色荧光减弱或消失。根据线粒体绿色荧光强弱可判断MPTP开放程度，绿色荧光越强表示开放程度越低，反之越高。本试剂盒以6孔板为例，可进行100次实验，适用于流式细胞仪、荧光显微镜和荧光酶标仪检测。

储存与运输

冰袋(wet ice)运输；-20℃保存；12个月有效。

组成

操作步骤

一、 溶液准备

1. 自备含钙镁HBSS缓冲液（推荐使用G4204，如无特殊说明，后续洗涤等步骤均使用含钙镁HBSS）

2. 1×Calcein AM染色工作液配制：取1 μL Calcein AM（1000×）、2 μL CoCl₂ (500×)和1 μL CaCl₂ (1000×)于1 mL染料稀释液中，混合均匀。（Calcein AM推荐使用浓度1×-1.5×，可在此范围内进行调整。）

3. Ionomycin 阳性对照液配制（可选）：在1×Calcein AM染色工作液中加入Ionomycin (1000×)使其终浓度为1×。

二、 贴壁细胞染色

1. 将细胞接种于培养皿、多孔细胞培养板或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。

2. 吸出培养液，用HBSS洗涤2-3次。

3. 染色液添加：加入适量体积的1×Calcein AM染色工作液到正常细胞和实验组细胞中，一般96孔板每孔体积为100 μL，24孔板每孔体积为250 μL，12孔板每孔体积为500 μL，6孔板每孔体积为1 mL。

4. 阳性对照组（可选）：加入适量体积的Ionomycin阳性对照液到正常细胞中，以打开线粒体通透孔。

5. 37℃避光孵育20 min（不同细胞孵育时间存在差异，可在15-45 min范围内调整）。

6. 孵育结束后吸出液体，用HBSS洗涤2-3次后，加入适量HBSS覆盖，可用荧光显微镜的GFP通道观察，也可用酶标仪Ex/Em：454/517 nm检测。如果需要用流式细胞仪检测，需要在染色前将细胞重悬后再进行后续实验。

三、 悬浮细胞染色

1. 细胞按实验设计进行一定处理后，计数。

2. 取适当细胞1000 g室温离心5 min，弃上清，用HBSS洗涤2-3次。

3. 染色液添加：1×Calcein AM染色工作液重悬细胞（此时细胞密度约为1×10⁶/mL）。

4. 阳性对照组（可选）：加入适量体积的Ionomycin阳性对照液到正常细胞中，以打开线粒体通透孔。

5. 37℃避光孵育20 min（不同细胞孵育时间存在差异，可在15-45 min范围内调整）。

6. 孵育结束后，1000 g室温离心5 min，吸除上清液，用HBSS重悬。

7. 重复2-3次。可用荧光显微镜的GFP通道观察，也可用酶标仪Ex/Em：454/517 nm检测和流式细胞仪检测。

注意事项

1. 如每次使用的Calcein AM较少，可分装成更小体积，尽量避免Calcein AM反复冻融，-20℃避光保存。

2. Calcein AM染色液应现配现用，不能提前配制，否则将影响染色效果。

3. 染色后不可用培养基覆盖或重悬，会影响染色结果。

4. CoCl₂溶液中若有少量沉淀析出，属于正常现象，室温溶解后可用。

5. CoCl₂有腐蚀性，对人体有害或有刺激性，对人体有呼吸道、生殖等特定器官毒性，或致畸致癌毒性,操作时请小心，并确保有效防护以避免直接接触人体或吸入体内，并须注意避免腐蚀其它物品。

6. 本产品对光敏感，操作过程尽量避免强光接触。

7. 本产品为检测活细胞试剂盒，染色前后不可固定。

8. 操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！