产品信息

产品简介

活细菌/死细菌染色试剂盒是一款利用SYTO 9绿色核酸染料和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染料进行细菌活、死染色的试剂盒，可使用酶标仪，流式细胞仪以及荧光显微镜等荧光分析仪器进行分析。适用于各种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，溶壁微球菌等。

该试剂盒含有SYTO-9和碘化丙啶（PI）两种荧光染料，其中SYTO-9是一种绿色核酸荧光染料，可染色膜完整的细菌和膜受损细菌；碘化丙啶（PI）是一种红色核酸荧光染料，仅染色膜受损的死细菌，而碘化丙啶（PI）的插入会引起SYTO 9染色荧光的降低。当细菌悬液中同时加入两种染料时，适当调整SYTO 9和碘化丙啶（PI）的比例，可使具有完整膜结构的细菌呈绿色荧光，而具受损膜结构的细菌呈红色荧光。两者染料与核酸结合后最大激发和发射波长分别是485/530 nm（SYTO 9）和485/630 nm（PI）。

细菌的生存活力，即在适合的培养物中细菌的繁殖能力。在一些条件下膜受损的细菌依旧可以繁殖，但在检测过程中会被判定为死细菌；而一些膜结构完整的细菌虽被判定为活细菌，却没有繁殖力。因此，如果该检测与生长测定之间存在较大差距时，应考虑以上原因。

按推荐的用法用量，如果用荧光酶标仪检测或流式细胞仪检测：每500 μL菌液加入1 μL染料混合液（1 μL SYTO-9 +1 μL PI），可做50次独立实验。如果采用荧光显微镜检测：每100 μL菌液加入1 μL染料稀释液（1 μL SYTO-9 +1 μL PI+8 μL 0.85% NaCl），可做500次独立实验。

储存与运输

冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，12个月有效。

组成

操作步骤

【注意】：本试剂盒进行细菌染色，核酸和其它培养基成分可能会以不可预估的方式与SYTO 9和PI结合，导致染色结果与预期差别较大，故务必去除培养基残留，同时磷酸盐缓冲液也可能降低染色效率，推荐选用0.85% Nacl溶液。在实验过程中，如果发现绿光染色效率过低，或者红光过高，可以通过适量提高绿色染料的体积或者降低红色染料的体积调整荧光强度达到预期效果。

一、活细菌/死细菌制备（以大肠杆菌为例）

(1) 在LB液体培养基中将大肠杆菌培养至晚期对数期。

(2) 用EP管将菌液分成2份，将其中一份8000 g条件下离心10 min（另一份室温放置用来制备活细菌）。

(3) 去除上清液，加入适量的0.85% Nacl重悬细菌，再加入适量无水乙醇使乙醇的终浓度为70%乙醇，充分混匀，室温下孵育1 h，每15 min混合一次，用于制备死细菌。

(4) 将2份菌液在8000g条件下离心10 min。

(5) 去除上清，在两种样品中加入适量的0.85% NaCl重悬细菌，并如步骤4再次离心，并重悬。

(6) 使用分光光度计测定两种菌悬液在670 nm处的吸光值（OD670）。

(7) 调整两种菌悬液（活的和死亡的）的光密度使其OD670在0.01-0.1之间。

(8) 如下所示混合两种菌悬液以获得所需的活细胞：死细胞比率。

二、荧光显微镜操作步骤

(1) 将1体积的SYTO-9和1体积的PI在微量离心管中混合，充分混合后加入8体积的0.85% NaCl溶液以得到100×染料溶液。

(2) 每100 μL菌悬液，加1 μL的100×染料溶液。

(3) 充分混合，室温避光孵育15 min。

(4) 取5 μL染色后的菌悬液滴在载玻片上，再用18 mm方形盖玻片轻轻盖上。

(5) 在荧光显微镜下观察。活细菌（绿色荧光）和死细菌（红色荧光）可分别用FITC和Cy3通道观察拍照。

三、荧光酶标仪操作步

(1) 将等体积SYTO-9和PI在微量离心管中充分混合。

(2) 每500 μL菌液加入1 μL染料混合液。

(3) 充分混合，室温避光孵育15 min。

(4) 吸100 μL染色后的细菌悬液混合物到平底96孔板的各孔内，每个样品可做3个平行。

(5) 荧光测定和数据分析

    ①以~485nm为激发波长，~530nm为发射波长（emission 1，绿色）来测定每孔荧光

    ②以~485nm为激发波长，~630nm为发射波长（emission 2，红色）来测定每孔荧光；

    ③通过测定两种发射波长下的荧光强光，并计算荧光比值=emission1/emission2;

    ④以大肠杆菌悬液内活细胞的比例为横坐标，以emission1/emission2为纵坐标，制线形图。

四、流式细胞仪操作步骤

(1) 将等体积SYTO-9和PI在微量离心管中充分混合。

(2) 每500 μL菌液加入1 μL染料混合液。

(3) 充分混合，室温避光孵育15 min。

(4) 使用流式分析仪分析，SYTO使用FITC通道检测SYTO-9(绿光，活菌)，PI使用PE/PC5.5通道检测PI（红光，死菌）。

注意事项

1. 由于SYTO-9和碘化丙啶（PI）组分较少，务必开盖前先低速离心。

2. 首次使用后可将染料小量分装保存，避免反复冻融和污染。

3. 大肠杆菌建议光密度OD670为0.03-0.1，枯草芽孢杆菌建议光密度OD670为0.01-0.1，溶壁微球菌建议光密度OD670为0.01-0.1。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！