产品信息

产品描述

细胞凋亡是发生在胚胎发育和维持组织稳态过程中的正常生理过程，伴随着许多形态学特征改变，其中细胞膜的丢失是细胞凋亡早期的特征之一。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)只分布在细胞膜磷脂双分子层的内侧，但在细胞凋亡早期，PS会从脂膜的内侧翻转外侧，使其暴露于细胞外侧。Annexin V（膜联蛋白V）是一种Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，会与暴露PS的细胞特异性结合，因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的指标之一。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过具有完整细胞膜的正常细胞和早期凋亡细胞，但能透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜并将细胞核染色。

本产品通过将Annexin V用IF488荧光染料分子进行标记后作为检测探针，检测细胞的早期凋亡。同时以PI区分存活的细胞与坏死、晚期凋亡细胞。Annexin V-IF488和PI结合使用，活细胞呈现阴性染色（Annexin V^-/PI^-），早期凋亡细胞呈现单荧光阳性（Annexin V⁺/PI^-），而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现双荧光阳性（Annexin V⁺/PI⁺）。本试剂盒适用于流式细胞仪或荧光显微镜检测。

储存与运输

冰袋（wet ice）运输；2-8℃避光保存，12个月有效。

组成

操作步骤

1. 悬浮细胞：取细胞悬液，经500 g，4℃离心5 min收集细胞；

贴壁细胞：先收集细胞培养上清液。然后用不含EDTA的胰酶（推荐G4002或G4011）消化后，与细胞培养上清液合并，经500 g，4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以免过度消化引起假阳性。

2. 用预冷的PBS（推荐G4202）清洗细胞2次，每次500 g、4℃离心5 min收集细胞；

3. 用预冷的1×Binding Buffer轻柔重悬细胞，调整细胞浓度至1~5×10⁶/mL；

4. 取100 μL细胞悬液，加入5 µL Annexin V-IF488和5 µL PI，轻柔混匀，室温避光8-10 min；

5. 加入400 µL预冷的1×Binding Buffer，轻轻摇匀，1 h内用流式细胞仪或者荧光显微镜进行检测。

结果分析

1. 流式细胞仪检测

a. 流式细胞仪检测分析时选择合适的电压并调好光补偿，除实验组外建议设置阴性对照（不加任何标记物）用于调节电压，单标对照（只加Annexin V-IF488和只加PI）用于调节补偿；

b. 流式细胞仪检测分析参考实例：

用5 µM Camptothecin诱导Jurkat T淋巴瘤细胞6 h，参照以上实验步骤，用流式细胞仪进行检测，结果如下图所示。

IF488最大激发波长为491 nm，最大发射波长为518 nm；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm。经流式细胞仪相关分析软件绘制双色散点图，IF488位于横坐标，PI位于纵坐标。在典型实验中，活细胞无荧光，散点位于左下第一象限。处于早期凋亡细胞有较强的绿色荧光，散点位于右下第二象限。晚期凋亡细胞、坏死细胞呈现红色、绿色双重荧光，散点位于右上第三象限。

2. 荧光显微镜检测

在载玻片上加6 µL Annexin V-IF488和PI双染的细胞悬液，盖上盖玻片，在荧光显微镜下用双色滤光片进行观察，Annexin V-IF488呈绿色荧光信号，PI呈红色荧光信号。【用荧光显微镜拍照时建议加入适量抗荧光淬灭封片剂（G1401）以防止出现荧光淬灭问题】

注意事项

1. 整个实验过程操作应尽量轻柔避免细胞破碎，影响实验结果。

2. 用PBS清洗细胞不可省略，同时也要尽可能的去掉残留的PBS。

3. 操作过程中如使用了胰酶，务必用血清终止消化并尽可能去除残留胰酶。

4. 贴壁细胞凋亡刺激后，会有部分细胞飘起，同时收集细胞培养上清中的细胞，会使得结果更加准确。

5. 细胞凋亡是一个持续动态的过程，且荧光物质会发生淬灭，所以反应结束后应尽快进行检测，全程也应尽量避光操作。

6. 细胞的早期凋亡检测建议进行预实验对相应步骤进行优化。

7. 实验过程中请穿实验服并戴一次性手套，避免污染，确保安全。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）