本产品中自噬双标慢病毒mRFP-EGFP-LC3B，是一种红色荧光蛋白mRFP、增强型绿色荧光蛋白EGFP与自噬相关蛋白LC3B融合的慢病毒，可用于标记及追踪LC3B以及自噬流的变化。在非自噬的情况下，荧光显微镜下mRFP-EGFP-LC3B以弥散的黄色荧光（mRFP和EGFP的综合效果）形式存在于细胞质中；而在自噬的情况下，荧光显微镜下mRFP-EGFP-LC3B则聚集在自噬体膜上，以黄色斑点的形式表现出来（LC3B dot）；当自噬体与溶酶体融合后，因EGFP荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。本产品中慢病毒颗粒含量为1×108 TU/mL，病毒中携带嘌呤霉素抗性基因，可以通过添加嘌呤霉素加压，筛选出稳定表达的细胞株。

产品信息

产品简介

本产品中自噬双标慢病毒mRFP-EGFP-LC3B，是一种红色荧光蛋白mRFP、增强型绿色荧光蛋白EGFP与自噬相关蛋白LC3B融合的慢病毒，可用于标记及追踪LC3B以及自噬流的变化。在非自噬的情况下，荧光显微镜下mRFP-EGFP-LC3B以弥散的黄色荧光（mRFP和EGFP的综合效果）形式存在于细胞质中；而在自噬的情况下，荧光显微镜下mRFP-EGFP-LC3B则聚集在自噬体膜上，以黄色斑点的形式表现出来（LC3B dot）；当自噬体与溶酶体融合后，因EGFP荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。

本产品中慢病毒颗粒含量（病毒滴度）为1×10⁸ TU/mL，病毒中携带嘌呤霉素抗性基因，可以通过添加嘌呤霉素加压，筛选出稳定表达的细胞株。

储存与运输

干冰（dry ice）运输；-80℃保存，12个月有效期。

组成

操作步骤

一、实验前准备

1. 细胞消化、离心、重悬、计数后，根据细胞生长特性，接种至合适的培养板中。推荐细胞的接种量以16~24 h后汇合度达到30-50%为宜。

2. （可选）同一批次实验中，建议多接种一个孔的细胞用于滴加慢病毒前的细胞计数，便于计算每孔的病毒使用量。

二、细胞转染

1. 预热细胞培养基，备用。

2. 从-80℃冰箱中取出慢病毒，放入4℃冰箱或冰盒中解冻，备用。

3. 感染病毒之前，给细胞更换成新鲜、预热后的培养基（24孔板每孔300~500 μL、12孔板每孔400~800 μL、6 孔板每孔1~1.2 mL）。

4. 参考计算公式：病毒体积=MOI×细胞数量÷病毒滴度，根据细胞适宜的MOI及病毒滴度，加入相应体积的病毒悬液；充分混匀病毒悬液和培养基后将细胞放回培养箱。

5. 6~8 h后观察细胞状态，若发现形态变化或其他明显异常，则需更换新鲜无病毒的培养基；若无异常，可延长孵育培养（12-16h）后更换新鲜培养基，以获得更好的感染效果。

三、抗生素筛选

1. 使用本品慢病毒转染的细胞，一般可在24 h观察到红色荧光和绿色荧光的表达，在48~72 h表达量至峰值。

2. 观察细胞的荧光率和表达强度，在转染48 h后即可开始药筛，推荐和参考使用《G4017 嘌呤霉素溶液（10 mg/mL）》，每2~3天更换一次含有嘌呤霉素的完全培养基，筛选1周左右，直到细胞基本都带荧光（注：如有必要，可根据需求筛选单克隆，或者流式细胞术分选荧光较强的细胞）。

3. 自噬诱导：通过饥饿、药物等诱导细胞自噬，通过荧光显微镜下红绿荧光斑点的变化：黄色斑点（红 +绿叠加）代表自噬小体（酸性环境弱，EGFP和 mRFP均发光）；红色斑点（仅mRFP发光）代表自噬溶酶体（溶酶体酸性强，EGFP荧光淬灭，仅耐酸性的mRFP保留信号）。由此，可同时观察自噬小体和自噬溶酶体的形成与转化。

注意事项

1. 用于转染的细胞需保证无支原体污染，多个种类的支原体会严重影响慢病毒的活力，造成感染效果差。

2. 本产品为失活慢病毒，请在生物安全二级的环境中处理本品，操作时需做好充足的防护工作。请勿与其他非相关细胞实验同时进行。

3. 若操作过程中有病毒溶液飞溅、倾洒，请立即使用70%酒精或0.06%次氯酸钠溶液擦拭干净。若操作中有病毒溶液接触到皮肤，请立即使用大量肥皂水、消毒洗手液和清水冲洗接触部位的皮肤；若不慎接触伤口或入眼，请用大量肥皂水或清水冲洗后及时至就近医院处理。

4. 经慢病毒转染后的细胞也需要在生物安全二级的环境中进行后续实验，实验期间产生的物废液废请用84消毒液、煮沸、高温灭菌等方式无害化处理后丢弃。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！