羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒（不含高氯酸盐）
- 48 T
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒（不含高氯酸盐） | Y4322-48T | 48T |
产品简介
羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)是脯氨酸（proline）经过羟基化酶（prolyhydroxylase enzyme）催化之后的产物，是胶原蛋白（Collagen）的一种特有氨基酸，约占胶原全部氨基酸残基的13.5%。胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，羟脯氨酸的测定对胶原蛋白代谢的研究有重要意义。
本产品检测羟脯氨酸含量，其原理为样品经碱水解产生游离的HYP，进一步被氧化剂氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛（DMAB）反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。此外，羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒（不含高氯酸盐）使用专有的酸性显影液来准确测量组织和蛋白质/肽酶水解物中的羟脯氨酸，而不使用危险的高氯酸盐，并且产生的比色结果与传统的高氯酸法几乎相同。
储存与运输
冰袋(wet ice)运输；-20℃避光保存（其中Y4322-1、Y4322-2、Y4322-5，2-8°C保存, Y4322-8常温保存），12个月有效。
试剂盒组成
Component Number | Component | Y4322-48T |
Y4322-1 | 碱水解液 | 10 mL |
Y4322-2 | 酸溶液 | 80 mL |
Y4322-3 | 氧化缓冲液 | 2.5 mL |
Y4322-4 | 氧化剂 | 500 μL |
Y4322-5 | 显影液 | 3 mL |
Y4322-6 | 显色剂 | 3 mL |
Y4322-7 | 羟脯氨酸标准品 | 50 μL |
Y4322-8 | 活性炭 | 一管 |
说明书 | 1份 | |
操作步骤
1. 样品、试剂准备：
1.1. 血清、尿液样品：20 µL尿液或血清加20 µL碱水解液，混匀，在100°C下水解3小时。水解后冷却，加入160 µL的酸溶液来中和水解液。涡旋混匀，10000×g离心5分钟，去除沉淀，将澄清的上清液转移到新管中待测。注：对于尿液样本，离心前向中和的水解液中加入4-10毫克的活性炭，用活性炭脱色。
1.2. 组织样品：15 mg组织加入150 µL超纯水进行匀浆。匀浆后不离心，加入150 µL碱水解液，混匀后在100°C下水解3小时。水解后冷却，加入1.2 mL的酸溶液来中和水解液。漩涡混匀，10000×g离心5分钟，将澄清的上清液转移到新管中。若上清液有颜色，也可在离心前加活性炭进行脱色。
1.3. 氧化剂工作液：按照8 µL氧化剂：42 µL氧化缓冲液的比例进行配制，如检测10个样本，则取80 µL氧化剂，加入420 µL氧化缓冲液，得到10份氧化剂工作液。
1.4. 5 µg/mL标准应用液：1 mg/mL的羟脯氨酸标准品，用双蒸水稀释200倍，如：5 μL羟脯氨酸标准品，加995 μL双蒸水混匀后得到5 µg/mL标准应用液。
2. 羟脯氨酸含量检测：
2.1. 按照下表，在YP管中进行操作
空白管 | 标准管 | 测定管 | |
双蒸水 | 100 μL | ||
5 µg/mL 标准应用液 | 100 μL | ||
样本 | 100 μL | ||
氧化剂工作液 | 50 μL | 50 μL | 50 μL |
混匀，室温静置 10 分钟 | |||
显影液 | 50 μL | 50 μL | 50 μL |
混匀，室温静置 5 分钟 | |||
显色剂 | 50 μL | 50 μL | 50 μL |
混匀，60℃水浴 15 分钟，冷却后，3500转/分离心10分钟，取200 μL于96孔板，在波长560 nm测定各孔吸光度值。 | |||
2.2. 含量计算
2.2.1 标准孔计算：
血清及尿液样本羟脯氨酸含量（μg/mL）=（A测定-A空白）÷（A标准-A空白）×C标准×V水解液÷V样
组织样本羟脯氨酸含量（μg/mg 组织湿重）=（A测定-A空白）÷（A标准-A空白）×C标准×V水解液÷W
2.2.2 绘制标准曲线：以HYP标准品浓度为横坐标X，绝对值OD（标准管减去空白管）为纵坐标Y，作标准曲线Y=aX+b。
血清及尿液样本羟脯氨酸含量（μg/mL）=（A测定-A空白-b）÷a×V水解液÷V样
组织样本羟脯氨酸含量（μg/mg 组织湿重）=（A测定-A空白-b）÷a×V水解液÷W
注：C标准：5 µg/mL ；V水解液：水解液总体积，0.2mL；V样：样本取样量，血清/尿液 0.02mL；组织样本如15 mg组织水解液总体积1.5 mL；W：组织湿重，mg；标准品稀释：1 mg/mL羟脯氨酸标准溶液，使用双蒸水稀释至20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0 μg/mL。
注意事项
1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
2. 软骨或者其他坚硬的组织，需要增加水解的时间，以确保样本水解完全。
3. 不同样本量，可以按照上述水解比例进行水解。
4. 本试剂盒中显色剂组分，可能因批次不同存在不同颜色，但不影响最终的吸光值测定。
5. 为了您的健康和安全，操作时请穿好实验服、戴好手套。
附录1：技术参数
检测指标 | 羟脯氨酸（HYP） | 回收率 | 100±5% |
样品类型 | 血清、组织、尿液 | 批内YV | <3% |
检测灵敏度及范围 | 0.315 μg/mL；0.315-20 μg/mL | 批间YV | <5% |
附录2：标准曲线制作示例（数据仅供参考）
根据说明书信息检测20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0 μg/mL梯度样本的吸光度结果如下示例：
浓度（μg/mL) | 0 | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 20 |
OD560 | 0.127 | 0.175 | 0.234 | 0.366 | 0.622 | 1.103 |
△OD560 | 0 | 0.048 | 0.107 | 0.239 | 0.495 | 0.942 |
以样本浓度为横坐标，△OD560结果为纵坐标，得到的标准曲线拟合方程为Y=0.0494X-0.008，R2=9996。
附录3：样本检测示例（数据仅供参考）
按照说明书操作测的一例肝脏组织样本的OD560为0.419，空白样本的OD560为0.127，计算此样本的△OD560为0.292。采用单孔计算时，根据5μg/mL标准品的△OD560为0.239，计算肝脏组织样本羟脯氨酸（HYP）浓度为0.292÷0.239×5×1.5÷15=0.610μg/mL；采用标准曲线计算时，将此样本的△OD560 0.205代入标准曲线拟合方程，计算出肝脏组织样本羟脯氨酸（HYP）浓度为（0.292+0.008）÷0.0494×1.5÷15=0.607μg/mL。
本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
（产品包装升级中，以实物为准。）
| 货号 | 名称 | 规格 | 价格 | 操作 |
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| 货号 | 名称 | 规格 | 价格 | 操作 |
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