谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）检测试剂盒（DTNB法）
- 96 T
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）检测试剂盒（DTNB法） | Y4321-48T | 48T |
Y4321-96T | 96T |
产品简介
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒（Se）水平。GPX能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。
本产品检测含硒的谷胱甘肽过氧化物酶，其原理为GPX催化H2O2氧化GSH，产生GSSG，GSH能与生色底物DTNB生成GSSG和黄色的TNB，在412 nm处吸光度的下降（GSH消耗）即可反应GPX的活性。由于这2个底物在没有酶存在的条件下也都能进行氧化还原反应（称非酶促反应），所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应引起的GSH减少。
储存与运输
冰袋(wet ice)运输；2-8℃避光保存，6个月有效。
组成
Component Number | Component | Y4321-48T | Y4321-96T |
Y4321-1 | 标准品稀释液 | 5 mL | 10 mL |
Y4321-2 | 谷胱甘肽标准品（GSH粉末） | 干粉1支 | 干粉2支 |
Y4321-3 | 双氧水溶液 | 100 μL | 200 μL |
Y4321-4 | 终止液 | 10 mL | 20 mL |
Y4321-5 | 检测缓冲液 | 5 mL | 10 mL |
Y4321-6 | 显色剂 | 30 μL | 60 μL |
说明书 | 1份 | ||
注意：产品规格以组织、细胞样品检测检测体系为准。
操作步骤
1. 样品及试剂准备：
1.1. 溶血液、血清（浆）样品：根据预实验的抑制率，选择合适的稀释倍数进行检测；
1.2. 组织样品：使用PBS进行匀浆裂解，其中组织和匀浆液的比例为1比9即可（如0.1 g组织比0.9 mL匀浆液）；匀浆裂解后，4℃，10000 g离心10-15 min，取上清置于冰上待测。留取部分上清用于蛋白浓度测定。
1.3. 细胞样品：细胞收集后，大约每1×10^6个细胞加300-500 μL PBS进行匀浆；匀浆裂解后，4℃，10000 g离心10-15 min，取上清置于冰上待测。留取部分上清用于蛋白浓度测定。
1.4. 1 mmol/L GSH标准品储备液配制：谷胱甘肽标准品（GSH粉末）在低速离心机上离心，确保粉末都在管底；使用2 mL标准品稀释液溶解。建议分装后-20℃保存，1个月内用完；
1.5. 双氧水工作液：双氧水溶液，使用无菌超纯水100倍稀释使用，现配现用。
1.6. 显色剂工作液：显色剂，使用无菌超纯水100倍稀释使用，现配现用。
1.7. 标准品稀释：1 mmol/L GSH标准品储存液，使用标准品稀释液，稀释至400、200、100、50、25、12.5、6.25、0 μmol/L，取稀释液各20 μL/管，分别加入80 μL终止液进行稀释，得到0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L的标曲浓度。
2. GSH-PX含量检测：
2.1. 酶促反应：
酶管 | 非酶管 | |
样本 | 20 μL | |
1 mmol/LGSH | 20 μL | 20 μL |
37℃水浴，预温5 min | ||
双氧水工作液 | 10 μL | 10 μL |
37℃水浴，准确反应5 min | ||
终止液 | 200 μL | 200 μL |
样本 | 20 μL | |
4000 r/min，离心10分钟，取上清100 μL进行显色反应 | ||
2.2. 显色反应：
酶管 | 非酶管 | 空白管c | 标准管c | |
酶促反应上清液 | 100 μL | 100 μL | ||
空白试剂a | 100 μL | |||
20 μmol/L GSH标准液b | 100 μL | |||
检测缓冲液 | 100 μL | 100 μL | 100 μL | 100 μL |
显色剂工作液 | 50 μL | 50 μL | 50 μL | 50 μL |
37℃反应5 min，于412 nm波长处读取吸光值A。 | ||||
注a：空白试剂100 μL：20 μL标准品稀释液+80 μL终止液。
注b：20 μmol/L GSH标准液：1 mmol/L GSH标准品储存液，使用标准品稀释液稀释10倍，得100 μmol/L标准品。取100 μmol/L标准品20 μL+80 μL终止液，得20 μmol/L GSH标准液。
注c：空白管和标准管一般只需做1-2管。样本裂解后需尽快检测，长期放置导致活力降低。
3. 数据分析：
数据分析前，需计算待测组织或发酵液、细胞样品蛋白浓度。可通过BCA蛋白定量检测试剂盒（Y2037）对待测样品进行蛋白浓度检测（1 mmol/L=1 μmol/mL）。
定义：扣除非酶反应的作用，每毫克蛋白质在反应体系中，每分钟催化1 nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。
3.1 标准孔计算法
血清/浆GPX活力（U/mL）=（A样本非酶管-A样本酶管）÷（A标准-A空白）×C标准×V1÷V2÷T×f
组织/发酵液/细胞GPX活力（U/mg prot）=（A样本非酶管-A样本酶管）÷（A标准-A空白）×C标准×V1÷(V2×Cpr)÷T×f
3.2 标准曲线法:以标准品浓度梯度为横坐标x，△OD412为纵坐标y，制作标准曲线y=ax+b。
注：标准管浓度：20 μmol/L；V1：酶促反应体积0.25 mL；V2：酶促反应中加入的样本体积0.02 mL；Cpr：样本蛋白浓度，单位mg/mL；T：反应时间，5min；f：样本加样前稀释倍数。
注意事项
1. 本试剂盒检测时涉及氧化还原反应，因此所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定。如果在样品中的还原剂无法避免，例如DTT、巯基乙醇等，则这些还原剂的总浓度至少低于0.1 mmol/L。0.15 mmol/L的DTT可以抑制40%的酶活力。
2. 常用的Triton X-100、Tween-20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物，会影响本试剂盒的测定。如果必须使用这些去垢剂，最好使用纯度较高并注明含较低过氧化物的去垢剂。
3. 为了您的健康和安全，操作时请穿好实验服、戴好手套。
附录1：技术参数
检测指标 | 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX） | 回收率 | 100±5% |
样品类型 | 血液、组织、细胞 | 批内YV | <3% |
检测灵敏度及范围 | 1.25 μmol/L；1.25-80 μmol/L | 批间YV | <5% |
附录2：标准曲线制作示例（数据仅供参考）
根据说明书信息检测0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L梯度样本的吸光度结果如下示例：
浓度（ μmol/L) | 0 | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 |
OD412 | 0.085 | 0.09 | 0.094 | 0.101 | 0.118 | 0.155 | 0.23 | 0.377 |
△OD412 | 0 | 0.005 | 0.009 | 0.016 | 0.033 | 0.07 | 0.145 | 0.292 |
以样本浓度为横坐标，△OD412结果为纵坐标，得到的标准曲线拟合方程为Y=0.0037X-0.0013，R2=9998。
附录3：样本检测示例（数据仅供参考）
按照说明书操作测的一例稀释5倍的血清样本非酶管OD412为0.28，酶管OD412为0.0875，计算此样本的△OD412为0.1925。采用单孔计算时，根据20μmol/L标准品的△OD412为0.07，计算血清样本谷胱甘肽过氧化物酶浓度为0.1925÷0.07×20×0.25÷0.02÷5×5 =687.5U/mL；采用标准曲线计算时，将此样本的△OD4120.1925代入标准曲线拟合方程，计算出血清样本谷胱甘肽过氧化物酶浓度为（0.1925+0.0013）÷0.0037×0.25÷0.02÷5×5 =654.73U/mL。
本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
（产品包装升级中，以实物为准。）
| 货号 | 名称 | 规格 | 价格 | 操作 |
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| 货号 | 名称 | 规格 | 价格 | 操作 |
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