产品信息

产品简介

谷胱甘肽（谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸）是一种由3个氨基酸残基组成的小肽，广泛存在于机体中。谷胱甘肽以还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）2种不同的形式存在，并且可以在一定条件下互相转换。GSH是动物细胞中重要的抗氧化剂，且是绝大多数细胞巯基的主要来源。在生理条件下，由于GSSG会被谷胱甘肽还原酶酶促还原，因此，GSH是机体内主要存在形式。

本试剂盒利用谷胱甘肽还原酶将GSSG还原成GSH，再通过GSH与DTNB反应，生成TNB和GSSG。其中产生的TNB与总谷胱甘肽呈现正相关性，因此，可通过测定TNB产生量来评估总谷胱甘肽（T-GSH）的量。同时本试剂盒中提供GSH清除剂，可用其去除样品中原有GSH，剩余的GSSG在谷胱甘肽还原酶的作用下再次转换生成GSH，然后和DTNB反应，从而测得GSSG含量。

储存与运输

冰袋运输；-20℃避光保存，6个月有效。

组成

注意：如果需要同时检测T-GSH和GSSG，试剂盒检测次数为对应规格的一半。

操作步骤

1. 样品以及前准备：

1.1. 样品前处理

1.1.1. 血浆、血清样品：1比1比例加入蛋白去除试剂，充分混匀；4℃，10000 g 离心 10-15 min，取上清用于后续检测；

1.1.2. 组织样品：添加蛋白去除试剂到组织中进行匀浆裂解（重量mg：体积μL为1：9，例如：20 mg比180 μL）；匀浆裂解后，4℃，10000 g 离心 10-15 min，取上清用于后续检测；

1.1.3. 细胞样品：细胞收集后，使用蛋白去除试剂重悬细胞，大约每1 X 10⁷个细胞加100-200 μL 试剂，对其进行超声或冰上裂解 10-20 min；处理后，4℃，10000 g 离心 10-15 min，取上清用于后续检测；

1.2. 标准品配置和准备：

1.2.1. 谷胱甘肽标准品（GSSG粉末）在低速离心机上离心，确保粉末都在管底；使用500 μL无菌超纯水溶解，配制成谷胱甘肽标准品（GSSG，1 mmol/L），建议分装后-20℃保存，1个月内用完；

1.3. 标准品浓度梯度：使用蛋白去除试剂将谷胱甘肽标准品（1 mmol/L）进行梯度稀释（例如取其40 μL标准品加入上述960 μL蛋白去除试剂中，稀释为40 μmol/L，并进一步梯度稀释做标准曲线，即40/20/10/5/2.5 μmol/L），与待测样品进行后续检测后，用于标准曲线法数据分析。

1.4. 将谷胱甘肽检测缓冲液：谷胱甘肽还原酶：检测探针=150:10:1，配置成谷胱甘肽检测工作液；

2. 总谷胱甘肽（T-GSH）检测：

2.1 对总谷胱甘肽检测样品进行前处理（注意：因为GSSG检测需要对样品进行前处理工作，为了确保体系的一致性，此处需对样品进行同体系前处理后，再进行总谷胱甘肽检测）；

2.2 参考下表进行总谷胱甘肽检测（此处待测样品，为2.1步骤处理过的样品）；

3. 氧化型谷胱甘肽（GSSG）检测：

3.1 参考下表对还原型谷胱甘肽进行清除处理；

3.2 参考下表对氧化型谷胱甘肽进行检测（此处待测样品，为3.1步骤处理过的样品）

4. 数据分析：

4.1. 根据梯度稀释的标准组值-空白组值数据使用Excel等软件绘制T-GSH和GSSG标准曲线：Y₁=a₁ X₁+ b₁和：Y₂=a₂ X₂+ b₂；

4.2. 血液样品T-GSH和GSSG含量计算：

单位血清样品T-GSH含量(μmol/L)=(ΔA₁-b₁)÷a₁×2^*×D^*×f

单位血清样品GSSG含量(μmol/L)=(ΔA₂-b₂)÷a₂×D^*×f

4.3. 组织样品T-GSH和GSSG含量计算：

单位组织样品T-GSH含量(μmol/kg)=(ΔA₁-b₁)÷a₁×V÷m×2^*×f

单位组织样品GSSG含量(μmol/kg)=(ΔA₂-b₂)÷a₂×V÷m×f

4.4. 细胞样品T-GSH和GSSG含量计算：

单位细胞样品T-GSH含量(μmol/10^9 cell)=(ΔA₁-b₁)÷a₁×V÷n×2^*×f

单位细胞样品GSSG含量(μmol/10^9 cell)=(ΔA₂-b₂)÷a₂×V÷n×f

注意：还原型谷胱甘肽含量（μmol/L）=总谷胱甘肽含量（μmol/L）-2×氧化型谷胱甘肽（μmol/L）

注解：Y₁ 和Y₂分别为T-GSH和GSSG标准组OD值-空白组OD值；X₁和X₂分别为T-GSH和GSSG含量；a₁和a₂分别为T-GSH和GSSG标准曲线斜率；b₁和b₂分别为T-GSH和GSSG标准曲线截距；ΔA₁和ΔA₂分别为T-GSH和GSSG：样品组OD值-空白OD组值；D^*为血清和蛋白去除试剂混合后稀释的倍数，2倍；2^*为GSSG换算成GSH时，需要乘以2；V为匀浆裂解组织或细胞使用的蛋白去除试剂的体积（mL）；m为组织湿重（g）；n为细胞量（10⁶个）；f为稀释倍数。

注意事项

1. 使用前充分溶解并轻轻晃动各类试剂，确保各成分在均匀条件下使用。

2. 不同样品含量不同，请根据实际情况，适当提高或降低样品浓度。

3. 本试剂盒可以根据需要只检测总谷胱甘肽或氧化型谷胱甘肽，也可以都检测。

4. 谷胱甘肽检测工作液和检测探针工作液现配现用。

5. 当最终计算异常，可能是样品GSH清除出现异常，可以视情况提高或降低GSH清除剂使用量或者孵育时间。

6. 初次使用可视情况适当分装储存，以避免反复冻融影响试剂性能。

7. 使用标准曲线法分析数据时，确保标准曲线R²＞0.99。

8. 还原剂以及巯基活性化合物会严重干扰本试剂盒的测定。

9. GSH清除剂具有刺激性气味，相关操作请于通风橱中进行。

10. 为了您的健康和安全，操作时请穿好实验服、戴好手套。

附录1：技术参数

附录2：标准曲线制作示例（数据仅供参考）

根据说明书信息检测总谷胱甘肽40、20、10、5、2.5、0 μmol/L梯度样本的吸光度结果如下示例：

以样本浓度为横坐标，△OD₄₁₂结果为纵坐标，得到的标准曲线拟合方程为Y=0.0124X-0.0042，R²=0.9984。

根据说明书信息检测氧化型谷胱甘肽40、20、10、5、2.5、0 μmol/L梯度样本的吸光度结果如下示例：

以样本浓度为横坐标，△OD₄₁₂结果为纵坐标，得到的标准曲线拟合方程为Y=0.0112X-0.0061，R²=0.999。

附录3：样本检测示例（数据仅供参考）

按照说明书操作测总谷胱甘肽的一例血清样本的OD₄₁₂为0.139，空白样本的OD₄₁₂为0.126，计算此样本的△OD₄₁₂为0.013。采用标准曲线计算，将此样本的△OD₄₁₂ 0.013代入标准曲线拟合方程，计算出总谷胱甘肽含量为（0.013+0.0042）÷0.0124×2×2=5.548 μmol/L。

按照说明书操作测氧化型谷胱甘肽的一例血清样本的OD₄₁₂为0.123，空白样本的OD₄₁₂为0.12，计算此样本的△OD₄₁₂为0.003。采用标准曲线计算，将此样本的△OD₄₁₂ 0.003代入标准曲线拟合方程，计算出氧化型谷胱甘肽含量为（0.003+0.0061）÷0.0112×2=1.626 μmol/L。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）