产品信息

产品简介

TGF-β1是转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族中的一员。TGF-β1首先以Pre-Pro-TGF-β1的形式产生。在通过二硫键去除信号肽和同源二聚化后，Pro-TGF-β1被前蛋白转化酶Furin切割。成熟的TGF-β1羧基末端二聚体会与其前体蛋白Latency Associated Peptide（LAP）氨基末端二聚体保持非共价结合，形成无活性的Latent TGF-β1复合物。随后，Latent TGF-β1可以单独分泌或通过Cys 33与Latent TGF-β1结合蛋白（LTPB）一起分泌。成熟的TGF-β1需要从LAP释放才能激活。研究表明TGF-β1广泛参与体内各种病理生理过程，与炎症、创伤、器官纤维化等多种疾病的发生、发展关系密切，尤其是在肿瘤的发生、发展中的调节作用，对肿瘤的研究具有极其深远的意义。Mouse TGF-β1 ELISA Kit通过双抗体夹心酶联免疫吸附技术，体外定量检测小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关液体中的TGF-β1，可同时检测天然的和重组的小鼠TGF-β1。

储存与运输

冰袋运输；4℃保存，有效期12个月；开封后需在4周内用完。

组成

需准备的材料设备

1. 能够检测450 nm吸光度的酶标仪，参考波长630 nm（建议参考仪器使用说明提前预热）；

2. 单道或多道移液器及吸头，加样槽，离心管；

3. 蒸馏水或去离子水；

4. 干性滤纸或吸水纸；

5. 涡旋混匀仪，微孔板振荡器。

样本的采集与保存

1. 血清样本：采集血样，静置30分钟，血液凝固。取液体部分进行离心分离，1000 g离心15分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA、枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂收集血浆样本，并将样本在采集后的30分钟内于2-8℃1000 g离心15分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。

注意：TGF-β是介导肝脏纤维发生的关键细胞因子，据报道血小板可通过促进腺苷生成抑制HSC活化，同时血小板颗粒中储存着大量的腺嘌呤核苷酸(如ADP和ATP)，可以降解成腺苷，腺苷灭活后的静态HSCs产生TGF-β的能力可能降低。血小板颗粒中TGF-β1的释放取决于血小板的活化。因此，测定TGF-β1外周水平，应该收集贫血小板的血浆样本，由于临床实验室收集血浆样本的很多操作，都没有彻底的去除血浆样本中的血小板。这就导致因血小板活化释放TGF-β1，造成实验结果的变异和不可重复。

3. 细胞培养上清：300 g离心10分钟，吸取上清即可检测，或者分装，分装上清置于-20℃以下保存，避免反复冻融。

样本的活化

在使用本试剂盒检测前，需按照下表将Latent TGF-β1活化为具有免疫反应性的TGF-β1。先对检测样本进行酸化和中和处理后，再进行检测分析。应使用聚丙烯材质试管进行活化操作。

注意：

1. 样本如果浑浊，必须离心去除沉淀物，不适用严重溶血或高血脂的样本。

2. 由标准曲线计算出的浓度值必须乘上稀释因子，小鼠血清：×50；小鼠血浆：×4；细胞培养上清：×1.4。

3. 冷冻样本使用前应缓慢平衡至室温。

4. 不要活化标准品，试剂盒中的标准品为活化的小鼠TGF-β1。

试剂的配制

1. 提前20分钟将试剂盒及样本从冰箱中取出，平衡至室温。按实验需求取出本次实验所需板条和试剂，每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。

2. 1×洗液配制：取25×浓缩洗液30 mL至1 L的量筒，加蒸馏水或去离子水至750 mL，轻轻混匀。转移至干净瓶内。

3. 标准品配制：将稀释液A按照标签标注体积加入标准品中，轻柔涡旋振荡，确保充分混匀。重溶后的标准品浓度为4000 pg/mL，即为浓缩的小鼠TGF-β1标准品。重溶后静置10分钟，稀释前充分混匀。

a) 血清/血浆样本标准曲线制备：

充分混匀重溶后的标准品，取500 µL浓缩的小鼠TGF-β1标准品，加入500 µL稀释液A，作为标准曲线的最高浓度S7（2000 pg/mL）。取6个1.5 mL离心管（S1-S6）依次排列，各加入500 µL稀释液A。吸取500 µL S7（2000 pg/mL）标准品到第一个离心管S6中，轻轻吹打混匀。从S6中吸取500 µL到第二个离心管S5中，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为稀释液A。

b) 细胞培养上清样本标准曲线制备：

充分混匀重溶后的标准品，取500 µL浓缩的小鼠TGF-β1标准品，加入500 µL细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度S7（2000 pg/mL）。取6个1.5 mL离心管（S1-S6）依次排列，各加入500 µL细胞培养基。吸取500 µL S7（2000 pg/mL）标准品到第一个离心管S6中，轻轻吹打混匀。从S6中吸取500 µL到第二个离心管S5中，轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为细胞培养基。

4. 1×检测抗体配制：检测抗体短暂离心，用稀释液A按照1:100倍稀释至工作浓度。混匀制成1×检测抗体工作液，临用前配制。

5. 1×SA-HRP配制：SA-HRP短暂离心，用稀释液B按照1:100倍稀释至工作浓度。混匀制成1×SA-HRP工作液，临用前配制。

注意：

1. 未开封的试剂盒：未拆封的试剂盒可整盒保存于4℃，有效期12个月。

2. 已开封的试剂盒：有效期4周，冻干标准品溶解后不能再次使用，剩余试剂及时放置4℃保存。此外，请将未使用的板条用包含干燥剂的铝箔袋装好，并拉紧密封铝箔袋，置于4℃保存。

操作步骤

1. 加样：分别设标准孔、待测样本孔、空白孔。用稀释液A稀释标准品及样本，设标准孔7孔（S1-S7），每孔依次加入100 μL不同浓度的标准品，空白孔每孔加入100 μL稀释液A，余孔每孔加入待测样品100 μL；

2. 加检测抗体：用稀释液A将检测抗体稀释至工作浓度，每孔加检测抗体50 μL。封板膜封板，100-300 rpm振荡（保证每孔溶液不洒出且能充分混匀即可），室温振荡孵育2小时；

注意：1.步骤1和2尽快完成，前后间隔不超过10min，步骤顺序不能调换。

2.请先查阅相关文献确定样本中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或者最低标准品浓度，请进行适当稀释或浓缩后再检测。

3. 洗板：自动洗板或手工洗板，每孔洗涤液为300 μL，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将酶标板倒扣在吸水纸上适当用力拍干，弃去孔内液体；

4. 加SA-HRP：用稀释液B将SA-HRP稀释至工作浓度，每孔加1×SA-HRP工作液（临用前配制）100 μL，更换新的封板膜封板，100-300 rpm振荡（保证每孔溶液不洒出且能充分混匀即可），室温振荡孵育30分钟；

5. 洗板：重复步骤3；

6. 加显色液TMB：每孔加TMB底物溶液90 μL，更换新的封板膜，室温避光显色（反应时间应控制在10-30分钟，不要超过30分钟。当标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）；

7. 加终止液：每孔加终止溶液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不均一情况，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀；

8. 读数：在确保酶标板底部无水滴及孔内无气泡后，10分钟内使用检测波长450 nm和630 nm读值。校准后的 OD 值为450 nm的测定值滅去 630 nm的测定值。仅使用450 nm测定会号致OD值偏高，并 且准确度降低。

注意事项

1. 试剂盒按说明书保存，使用前室温平衡20-30分钟。

2. 标准品为冻干粉，所需加入的稀释液体积及稀释倍数，请严格按照试剂盒说明书进行操作。为保证标准品的精确性，标准品配制使用后，如果有剩余请勿再次使用。

3. 25×洗液在低温下可能有结晶，如果发现有结晶，请37℃温育使结晶完全溶解后再配制成工作液。

4. TMB对人体有刺激性，操作时请注意适当防护，避免试剂直接接触皮肤和眼睛。如不慎接触，请立即用大量清水清洗。

5. 试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作时请注意适当防护，避免试剂直接接触皮肤和眼睛。如不慎接触，请立即用大量清水清洗。

6. 如果发现显色液TMB出现混浊或颜色变成蓝色，请立即停止使用。

7. 不宜混用不同批号的试剂盒组份，每批次试剂盒均经过独立测试，不能混用。

8. 本试剂盒的操作在室温进行，要求严格控制室温在25-28℃。温度低于25℃会导致最终检测到的吸光度显著下降。

9. 检测标准品和样品时建议设置重复孔，以确保检测结果的可信度。

10. 在试剂盒的贮存或孵育过程中请避免强光照射。

11. 加样过程中需避免气泡的产生。

12. 在操作试剂盒或处理样本时请穿实验服，佩戴乳胶或一次性手套。

13. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅。

14. 为了避免微生物的污染及试剂与样本间的交叉污染，加样时请注意每个样品或标准品必须更换枪头。

15. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。

结果分析

1. 结果计算

为了获得更准确的实验结果，建议标准品及样本进行复孔检测。计算标准品和样本的平均OD值，然后减去空白孔的OD值。

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线，相关系数R值越接近1，拟合效果越好。回归分析确定最佳拟合曲线。

代入样本检测OD值，计算出样本浓度，若样本进行了稀释，应乘以稀释倍数，即为样本的实际浓度。

通过对浓度值和OD值取对数拟合，可以对标准曲线进行线性化。此过程可能可以得到更多样本的浓度，但数据的准确度会降低。

注意：如果样本按照说明书进行稀释，最终的稀释倍数为小鼠血清50倍稀释，小鼠血浆4倍稀释，细胞培养上清1.4倍稀释。如果样本进行了其它方式的稀释，计算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。

2. 典型数据

每次检测每块酶标板都必须设立单独的标准曲线。由于实验操作条件的不同（如操作者、洗板条件和温度条件等），每次实验标准曲线的OD值会有所差异。说明书提供的标准曲线仅供参考。

3. 灵敏度

小鼠TGF-β1的最低可检测浓度为18.75 pg/mL (3次独立实验的平均值)。

此值为20个空白孔测定的平均OD值加上两倍SD所对应的浓度值。

4. 精密度

精密度用样品测定值的变异系数YV表示。变异系数YV（%）=（标准偏差SD/平均值Mean）×100；

批内差：3个已知浓度的高、中、低样本在同一批次酶标板内重复测定20次，评估酶标板内的精密度。批内差：YV<10%。

批间差：3个已知浓度的高、中、低样本在3个不同批次的试剂盒间重复测定8次，评估酶标板间的精密度。批间差：YV<10%。

检测步骤概要

1. 实验前按说明书准备标准品、试剂及样本；

2. 加样（标准品或样本）100 μL/孔，检测抗体50 μL/孔，室温振荡2小时；

3. 洗涤5次后拍干，加SA-HRP工作液100 μL/孔，室温振荡30分钟；

4. 洗涤5次后拍干，加TMB底物90 μL/孔，室温避光孵育10－30分钟；

5. 加终止液50 μL/孔；

6. 10分钟内使用双波长450 nm和630 nm读值,校准后的OD值为450 nm的测定值减去630 um的测定值。

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