规格 SweMagrose His-Tag标签蛋白纯化磁珠（IDA-Ni） G3654-1ML 1 mL G3654-5ML 5 mL 产品简介 本产品是琼脂糖磁珠通过IDA修饰后螯合镍离子制备而成，可以对生物样本中的含组氨酸标签蛋白进行高效快速纯化，无需离心过滤操作。操作过程简单，适用于纯化细菌、酵母、细胞表达上清或内表达的可溶性组氨酸标签蛋白，也可结合高通量蛋白纯化设备进行蛋白筛选分离等操作。 Ni 2+ 具有6个配位数，具有较强的蛋白结合能力，Co 2+ 具有4个配位数，非特异性吸附更少，若对纯度有更高要求可选择本公司另外一款SweMagrose His-Tag标签蛋白纯化磁珠（IDA-Co），货号 G3655 。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；2-8℃保存，12个月有效期。 组成 Component Number Component G3654-1 M L G3654-5 M L G3654 SweMagrose His-Tag标签蛋白纯化磁珠（IDA-Ni） 1 mL 5 mL 说明书 1份 操作步骤 1. 各种试剂配置参考如下,用户可根据试剂情况选用合适的磁珠用量及缓冲液配方： Component Volume 10×PBS（200 mM Sodium Phosphate, pH7.4） 50 mL 10×咪唑缓冲液（200 mM Sodium Phosphate，5 M Imidazole, pH7.4） 50 mL 去镍剂（10 mM Tris-HCl, 500mM NaCl，100 mM EDTA, pH7.4） 10 mL 碱性清洗液（0.5 M NaOH, 2M NaCl） 10 mL 氯化镍（100 mM NiCl2） 15 mL 保存液（20%乙醇） 50 mL 2. 缓冲液配置： 目标蛋白与金属离子螯合磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各种缓冲液也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应自行设计实验，筛选出适合目标蛋白的缓冲液，包括结合缓冲液(Binding Buffer)，洗涤缓冲液(Washing Buffer )和洗脱缓冲液(Elution Buffer)。以下提供的缓冲液体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化，供用户参考。 Binding Buffer：20mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，5~20 mM Imidazole，pH7.4 Washing Buffer：20mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，20~50 mM Imidazole，pH7.4 Elution Buffer：20mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，500 mM Imidazole，pH7.4 3. 样品处理： 本操作说明书提供以下三种样品处理方法： a. 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：按每克细胞加入5~10 mL Binding Buffer，加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF)，重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，在冰上放置30 min，以降解核酸。另外，用户也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。 b. 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Binding Buffer稀释，即为粗蛋白样品。 c. 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS(自备)洗涤1次，弃上清，用适量含1%(v/v) Triton X-100或1%(v/v) NP-40的Binding Buffer重悬，加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF)，置于冰上10 min，即为粗蛋白样品。 4. 目标蛋白与磁珠结合： a. 磁珠预处理：使用 Binding Buffer对磁珠进行润洗，将润洗后的磁珠进行磁吸，去掉上清。 b. ⽤10 mLBinding Buffer悬浮2 g湿重的菌体，进⾏破碎和裂解之后，即为⽬标粗蛋⽩样品，加⼊到装有预处理磁珠的离⼼管中，将离⼼管置于漩涡混匀器振荡15 s。 c. 将离⼼管置于旋转混合仪上，室温旋转混合20～30 min（如果需要，可以在2～8℃ 的低温环境下，旋转混合1 h，防⽌⽬标蛋⽩降解)。 d. 将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液至新的离心管中以备后续检测，从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。 5. 磁珠洗涤： a. 加⼊10 mL Washing Buffer到装有磁珠的离⼼管中，轻轻翻转离⼼管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，移出清洗液到新的离⼼管中，以备取样检测。重复此述步骤1次。 b. 加入10 mL Washing Buffer到装有磁珠的离心管，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移到新的离心管(避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白)，磁性分离，移出上清液到清洗液收集管。 6.目标蛋白洗脱: a. ⽤户可根据需要改变洗脱体积调整⽬标蛋⽩浓度，加⼊2～10 mL Elution Buffer，轻轻翻转离⼼管数 次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离⼼管中，即为纯化的⽬标蛋白样品。 b. 如果需要，可以重复上述步骤1次，收集样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。 c. 通 过SDS-PAGE或Western blotting检 测 目 标 蛋 白 。 如 果 需 要 测 定 蛋 白 质 浓 度 ， 可 以 采 用Elution Buffer调零再进行测定，或者采用透析、超滤等方法去除Imidazole后再进行浓度测定。 7. 磁珠后处理： a. 在装有磁珠的离⼼管中加⼊5 mL Elution Buffer，上下翻转离⼼管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去除上清液。 b. 重复上述步骤2次。 c. 在离心管中加入5 mL ddH 2 O ，上下翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去除上清液 d. 重复上述步骤2次 e. 加入保存液到磁珠中使总体积为5 mL，保存于2～30℃ (长期保存，置于2～8℃)，可用于下一次同种蛋白的纯化。 8. 磁珠再生： 磁珠连续使用3次或以上，其结合目标蛋白的能力可能会明显降低，建议进行磁珠再生处理。以5 mL 10%(v/v)磁珠悬液为例，详细说明磁珠再生操作。 a. 将磁珠悬液进行磁性分离，去除上清液，从磁性分离器上取下离心管，在离心管中加入5 mL ddH 2 O ，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。 b. 加入5 mL去镍剂，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5 min，磁性分离，去除上清液。重复此步骤1次。 c. 加入5 mL ddH 2 O ，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液，重复此步骤 2次。 d. 碱处理(可选步骤)：加入5 mL 碱性清洗液，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5 min，磁性分离，去除上清液。加入5 mL ddH 2 O ，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复 ddH 2 O 洗涤步骤3～5次，至洗涤液呈...