规格 His标签蛋白纯化试剂盒（可溶蛋白） G2245-10ML 10 mL 产品简介 本试剂盒中包含Ni-NTA SweAgrose 6 Fast Flow填料、亲和柱空柱以及蛋白纯化所需的试剂。亲和填料Ni-NTA SweAgrose 6 Fast Flow对 6×His-tag 蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效纯化超声破碎或压力破碎后细胞上清中的可溶性His标签融合蛋白。Ni-NTA填料具有 4 个 Ni 2+ 螯合位点，与Ni-IDA相比，Ni-NTA结合 Ni 2+ 更为牢固，有效地防止纯化过程中 Ni 2+ 脱落并增强了对 His 标签蛋白的结合能力，提高纯化效率，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌）中的 His 标签蛋白均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接用于可溶性His标签融合蛋白的纯化，使用方便，快捷。 填料信息 指标名称 描述 产品内容 66%(v/v) 琼脂糖凝胶，保存于20%乙醇中 凝胶类型 6%交联琼脂糖凝胶 配基 -NTA- Ni 2+ 粒径范围（μm） 45 - 165 平均粒径（μm） 90 结合载量 20-50 mg (His标签蛋白)/mL介质 配基密度（μmol/mL） ~ 25 运行流速（cm/h） ≤600 耐压（MPa） 0.3 化学稳定范围 常用的水相缓冲液；0.01 M盐酸，0.1 M氢氧化钠 （1周）；1 M氢氧化钠，70%乙酸（1天）；2% SDS（1小时）；30% 2-丙醇（30分钟） 贮存 2-8℃ 20%乙醇 储存与运输 1. 包装： PP材质试剂瓶密封包装。 2. 贮存： 2-8℃，20%乙醇；填料避免冷冻。 3. 保质期： 填料2-8℃存放24个月，纯化试剂2-8℃存放12个月。 试剂盒组分 产品货号 产品组分 规格 储存温度 G2245-1 Ni-NTA SweAgrose 6 Fast Flow 10 mL 2-8℃ G2245-2 His-tag Binding Buffer A 5×100 mL 2-8℃ G2245-3 His-tag Elution Buffer B 100 mL 2-8℃ G6064-12 亲和层析柱空柱（12 mL） 10套 常温 EP-5001-J 离心管 50 mL（尖底 无菌无酶，单支装） 5个 常温 说明书 1份 产品使用方法： 1 缓冲液准备 可溶性蛋白纯化试剂盒缓冲液配方如下： His-tag Binding Buffer A: 25 mM Tris 500 mM NaCl pH 8.0 His-tag Elution Buffer B: 25 mM Tris 500 mM NaCl 500 mM Imidazole pH 8.0 可溶性蛋白重力柱纯化缓冲液推荐： 步骤 缓冲液配方 配制比例（50 mL） 裂解/柱平衡缓冲液 Binding Buffer 25 mM Tris 500 mM NaCl 10 mM Imidazole pH 8.0 Buffer A: 49 mL Buffer B: 1 mL 洗杂缓冲液 Wash Buffer 25 mM Tris 500 mM NaCl 40 mM Imidazole pH 8.0 Buffer A: 46 mL Buffer B: 4 mL 洗脱缓冲液 Elution Buffer 25 mM Tris 500 mM NaCl 500 mM Imidazole pH 8.0 Buffer B: 50 mL 注意： 推荐条件适用于大多数蛋白重力柱结合洗脱模式，可自行稀释调整咪唑浓度(Buffer A/B液按比例混合)进行分步洗杂和洗脱获得更好的蛋白纯化效果。 混合计算公式：B液所需体积(mL)=（所需咪唑浓度*所需咪唑浓度的体积）/500 ；取A液加入计算所得B液至所需体积，混合均匀备用。 本试剂盒试剂可直接用于纯化仪线性梯度洗脱。（下文中提及的Binding/Wash/Elution Buffer均指推荐的含咪唑溶液的平衡/洗杂/洗脱液）。 2. 层析重力柱组装及平衡处理： 重力柱组装： 详细方法可参考本公司亲和层析柱空柱（货号G6064-12）装柱流程； 筛板处理： 用纯水或者填料保存液预先对筛板进行脱气处理，将下筛板推至空柱底部后加入适量保存液浸润底部，封住下出液口； 装填： 将 Ni-NTA SweAgrose 6 FF 填料上下颠倒充分混匀后取适量加入层析柱(避免剧烈摇晃)，室温静置 10 min。待凝胶与溶液分层后，打开底部出液口让乙醇通过重力作用缓慢流出，同时将上筛板垂直推至填料表面，添加保存液至满柱，装柱完成； 平衡： 向装填好的柱子中加入 5 个柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净，再用 10 个柱体积的 Binding Buffer 平衡柱子。平衡结束后即可上样。 注意： 柱体积指填料体积；建议装填高度不超过空柱1/3；填料保护液占比约为总体积1/3，请根据填料载量及蛋白表达量选取合适地体积的乙醇和填料混合液。 3. 样品制备： 3 .1 细菌胞内表达 菌体处理： 离心收集菌体，加入10倍（w:v=1:10)Binding Buffer 后充分重悬，放置于冰上。重悬后菌液可进行超声破碎或压力破碎处理。 离心过滤： 4℃，15,000 g离心10-20 min。收集上清，0.45 μm滤膜过滤后备用。 注意： 根据蛋白表达量高低可调整重悬比例至1：5-1：25之间； 按实验需求，破菌前可自行在缓冲液中添加蛋白酶抑制剂、溶菌酶 、核酸去除剂、蛋白稳定试剂等。本试剂盒不提供相关试剂，可单独从本公司购买PMSF（#G2008）、Triton X-100（#GC204003）、重组溶菌酶（#G3407）、重组DNase I（#G3342）等相关产品。如使用其它公司产品，请按照相应说明书操作。 超声破碎及压力破碎条件请参考仪器相关操作说明，尽量保持破碎过程中样品低温 。 3 .2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋 白 离心处理： 离心收集得到上清，如上清中不含 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可过滤后直接上样，如含有 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需将上清可溶蛋白置换到Binding Buffer后上样。 4. 纯化流程： 上样： 将处理好的样品直接加入平衡好的柱子中。以加入的体积控制流速快慢，收集流穿用于 SDS-PAGE 分析蛋白质的结合情况； 淋洗： 使用5-10个柱体积的Binding Buffer冲洗上样后的柱子，洗去部分杂蛋白； 洗杂： 使用15-20个柱体积的Wash Buffer冲洗柱子，分管收集洗杂液用于 SDS-PAGE 分析蛋白质的洗杂程度。也可用考马斯亮蓝G250（#G2039）快速检测洗杂终点； 洗脱： 使用约5个柱体积的Elution Buffer冲洗柱子，分管收集洗脱液便于获得较好的纯度和浓度的洗脱样。 SDS-PAGE 分析蛋白质洗脱情况； 柱保存： 洗脱完成后，依次使用10个柱体积的去离子水洗涤柱子，5个柱体积的20%乙醇平衡柱子（乙醇浸没填料）。封柱后2-8℃保存。 注意：洗杂洗脱条件未达到预期纯化效果时，建议分段梯度洗脱以达...