本试剂盒自带透明液，可用于检测细胞、冰冻切片和大体组织的衰老细胞β-半乳糖苷酶含量及分布情况。大体组织染完色后可直接进行冰冻切片，切片经核固红复染细胞核呈红色后可在显微镜镜下进一步观察衰老细胞的含量及分布情况。根据细胞或冰冻切片染色步骤，每个样品染色液用量为1 mL计算，本试剂盒可完成100个样品的染色；根据大体组织染色步骤，每个组织染色用量为5 mL计算，本试剂盒可完成20个组织大体染色。 规格 衰老细胞β-半乳糖苷酶大体组织染色试剂盒 G1141-20T 20 T 产品简介 β-半乳糖苷酶是细胞溶酶体内的一种水解酶，通常在pH 4.0时表现活性，但在衰老细胞内该酶在pH 6.0表现高酶活性。随着组织细胞的衰老，β-半乳糖苷酶的表达水平及酶活性会显著增加。通常会采用β-半乳糖苷酶染色来反应组织细胞衰老情况。该染色具体反应原理为以X-Ga1（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下，半乳糖苷键被水解生成深蓝色不溶产物沉积于衰老细胞内进而显示出衰老细胞。 β-半乳糖苷酶大体组织染色可在不经过切片，不破坏组织原有空间结构的基础上直接进行组织整染，可有效直观地反应出整个组织衰老细胞含量及分布情况。大体组织染完色后可直接进行冰冻切片后在显微镜镜下进一步观察衰老细胞的含量及分布情况。根据大体组织染色步骤，每个组织染色用量为5 mL计算，本试剂盒可完成20个大体组织染色。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输；2-8℃避光保存，有效期12个月。其中X-Gal粉末如果配制成溶液后分装成小份-20℃保存，3个月内有效。 组成 Component Number Component G 1141-20T G1141-1 β-半乳糖苷酶染色固定液 100 mL G1141-2 β-半乳糖苷酶染色液A 100 mL G1141-3 β-半乳糖苷酶染色液B 1.2 mL G1141-4 DMF（二甲基甲酰胺） 5 mL G1141-5 X-Gal（powder） 100 mg G1141-6 透明液A液 100 mL G1141-7 透明液B液 100 mL 说明书 1份 操作步骤 试剂准备 1. 自备PBS缓冲液（推荐G4202）。 2. 将100 mg X-Gal粉末用5 mL DMF（二甲基甲酰胺）充分溶解混匀，分装至1.5 mL洁净离心管中，每管0.5 mL，-20℃避光保存。避免反复冻融。 3. 按照下表比例配制β-半乳糖苷酶染色工作液。如果是6孔板培养的细胞，每孔需要1.0-1.5 mL染色工作液，如果是12孔板，每孔需要0.5-1.0 mL染色工作液。根据样本量配制染色液，避免浪费。 Component Volume β-半乳糖苷酶染色液A 940 μL β-半乳糖苷酶染色液B 10 μL X-Gal溶液 50 μL 总体积 1 mL 大体组织染色步骤 1. 取材：常规处死实验动物，取下目的部位组织（用解剖镊小心去除组织外周的脂肪），将新鲜组织放入大小合适的离心管中，加入PBS缓冲液浸洗3次，每次1 min。 2. 固定：倾去PBS缓冲液，在含有组织的离心管中加入β-半乳糖苷酶染色固定液冰上固定30 min。 3. 染色：倾去固定液，加入PBS缓冲液浸洗3次，每次5 min。倾去PBS缓冲液，加入染色工作液浸没组织，放入37℃恒温培养箱避光孵育过夜。 4. 后固定：倾去染色工作液，加入PBS缓冲液浸洗3次，每次5 min。加入通用型组织固定液（G1101）固定24-48 h，肉眼可观察到阳性部位呈深蓝色。 5. （可选）拍照：倾去固定液，用PBS浸洗3次，每次5 min，滤纸吸除多余的液体(保持组织稍湿润即可)；取一张载玻片放置在带有刻度尺的黑色或者白色背景板上，将组织放在载玻片上，选择光线良好的地方，调整好相机的焦距和曝光度，进行拍照，亦可使用体式显微镜进行拍照。 6. 组织透明化处理：倾去PBS，在含有组织的离心管中加入透明液A，37℃孵育3-7 d（如果孵育时间超过四天，则需每三天更换一次试剂）。样本呈现均质的果冻胶状后，将样本转入稀释后的透明液B水溶液中（B液：纯水=1：1），37℃孵育1 d，再转入纯透明液B中，37℃孵育1 d以上，直至组织完全透明，组织可在B液中室温保存1个月。 7. 拍照：将组织从离心管中取出放在载玻片上（不需要浸洗），滤纸吸除多余的液体(保持组织稍湿润)即可进行拍照（拍照要求同步骤5）。 8. （可选）染色后切片：后固定或者透明化处理后的组织用纯水浸洗3次，每次5 min，之后进行常规冰冻切片（GP1008-1）。冰冻切片室温复温10 min后，纯水浸泡5 min，去除OCT，之后滴加核固红染液（推荐G1035）染色3 min，水洗3次，每次10 s。切片入无水乙醇脱水2次，每次5 min，再经二甲苯透明5 min后中性树胶封片。 注：细胞和冰冻切片β-半乳糖苷酶染色步骤参考衰老细胞β-半乳糖苷酶染色试剂盒（G1073）。 染色结果 组织中的衰老细胞呈深蓝色。 注意事项 1. X-Gal溶液需室温完全解冻混匀后再使用。 2. β-半乳糖苷酶染色液A和B需提前恢复至室温后再使用，配制好的染色工作液需充分混匀无沉淀方可使用。 3. 衰老细胞β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH条件，不能在CO 2 培养箱中进行孵育显色，否则会影响染色工作液的pH值，导致染色失败。 4. 配制染色工作液时请选择聚丙烯（PP）或玻璃材质的耗材，不能用聚苯乙烯（PS）材质的耗材。 5. 在显色2 h-过夜期间需多次观察显色情况，时间过短可能导致阴性结果；时间太长则可能导致假阳性。显色时间与样本本身所含的β-半乳糖苷酶量多少有密切关系。 6. 在配制染色工作液前，需检查染色液A的pH值，如果不是6.0（可能因保存条件导致pH发生改变），需用HCl或NaOH调节pH至6.0再使用。 7. 组织切片的β-半乳糖苷酶染色，对于样本的前期准备要求较高，样本需-80℃保存，并尽快完成检测。因为β-半乳糖苷酶非常容易失活，样本保存不当或时间过久，都可能导致酶失活，染色呈阴性。 8. 对于大体组织染色，新鲜组织需在30 min内取出，组织如果不能及时固定染色，可暂时放入-80℃冰箱保存，一周内进行固定染色。 9. 操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。 参考图片 β-半乳糖苷酶大体组织 染色