ALP碱性磷酸酶染色可以直观显示骨组织中成骨细胞的定位与含量变化。但常规室温脱钙，长时间脱钙，会导致骨组织中ALP酶不可逆失活，影响成骨细胞定位的染色效果，导致实验失败。推荐使用赛维尔低温脱钙仪（ SDH-5 ）,能持续在4℃低温下脱钙，并且通过优化的脱钙程序，更快的完成脱钙，结合赛维尔粘附载玻片（骨组织专用）（ G6078-50 ）能得到清晰有效的ALP染色结果。 规格 ALP碱性磷酸酶染色（偶氮偶联法）试剂盒 G1087-100T 100 T 产品简介 碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase，ALP) 广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织。ALP是一组同工酶，已发现有 ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5与 ALP6六种同工酶。其中第1、2、6 种均来自肝脏，第3种来自骨细胞，第4种产生于胎盘及癌细胞，而第5种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。本实验采用偶氮偶联法来显示碱性磷酸酶，其原理是在pH 9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使萘酚AS-BI磷酸酯水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐生成蓝色产物，以此证明碱性磷酸酶的定位和分布。 正常的骨代谢是通过成骨细胞生长与破骨细胞骨吸收而维持平衡。成骨细胞的标记酶是碱性磷酸酶（ALP）。通常采用ALP碱性磷酸酶染色来直观反应骨组织中成骨细胞的定位及含量变化。骨组织冰冻切片前需经脱钙处理，本染色试剂盒中的ALP染色专用脱钙液经2-8℃低温脱钙能有效保证ALP染色效果。经本产品染色后，含ALP的成骨细胞呈蓝色，定位于骨小梁边缘和软骨处，细胞核复染为红色。每片组织300-400 μL的用量，本试剂盒可以做100 T。 储存与运输 试剂盒A液和C液-20℃避光保存与运输，其余成分2-8℃保存与运输，12个月有效期。 组成 Component Number Component G 1087-100 T G1105 EDTA脱钙液（慢脱） 2×500 mL G1087-1 ALP染色试剂盒A液 4×10 mg G1087-2 ALP染色试剂盒B液 75 mL G1087-3 ALP染色试剂盒C液 2.5 mL G1087-4 ALP染色试剂盒D液 1.5 mL G1087-5 ALP染色试剂盒E液 40 mL 说明书 1份 脱钙液的使用 取目的部位骨组织用中性通用型组织固定液（ G1101 ）2-8℃固定，一周内将骨组织取出经流水冲洗10 min后置于本试剂盒的脱钙液中，于2-8℃浸泡脱钙（推荐使用我司SDH-10脱钙仪进行2-8℃低温脱钙），每3天更换一次脱钙液直到脱钙完全。因高温会影响酶活，为保证染色效果，建议脱完钙的骨组织进行冰冻切片后染色，不建议做石蜡切片染色。 染色前准备 配制ALP工作液： （1）取一支10 mg ALP染色试剂盒A液加入500 μL的超纯水震荡混匀，终浓度为20 mg/mL。 （2）依次取第一步配制的A液稀释液及B液，C液，D液按照1∶25∶1∶0.5的比率进行混合，震荡混匀。 （3）第（2）步的混合液经针式滤器过滤（0.45 μm 水系滤膜，WG4614）即得到ALP工作液。 注意：每片组织大约需要300-400 μL工作液，根据使用量配制，现配现用，避免浪费。 冰冻切片 操作步骤 （ 供参考 ） 1、切片处理：切片从-20℃冰箱取出，室温复温20 min后浸入纯水10 min待用。 2、试剂配制：在切片复温过程中，按以上方法配制ALP染色工作液。（2-8℃保存的染液需提前30 min取出恢复至室温） 3、孵育反应液：切片用组化笔（G6100）画圈圈住组织后平放于透明湿盒内（湿盒底部加少量纯水保湿）。圈内滴加配制好的ALP染色工作液将组织均匀覆盖（孵育液不宜滴加太多否则液体溢出圈外）。盖好湿盒后于37℃恒温恒湿培养箱中孵育20 min。 4、清洗：倾去切片上的孵育反应液后，用纯水清洗2-3次，每次5-10 s。 5、染核（可选）：组织上滴加ALP染色试剂盒E液染色4 min后，在摇床（DS-3D100）上用纯水清洗30s。 6、封片镜检：甘油明胶封片剂（G1402）封片镜检。 染色结果 骨组织沿骨膜内整齐排列的矮柱状成骨细胞呈蓝色，软骨处呈蓝色，骨小梁边缘呈蓝色，细胞核呈红色。其他软组织染色后含碱性磷酸酶的细胞呈蓝色，细胞核呈红色。 注意事项 1. ALP染色试剂盒A液不稳定，需-20℃避光保存。使用时需现配现用，若未使用完，可-20℃保存，一周内有效。 2. 配制ALP工作液过程中出现乳状混浊是正常现象，配制完成后立即过滤，溶液变清亮即可正常使用。 3. 做ALP染色的组织需要用中性通用型组织固定液（ G1101 ）2-8℃固定，固定一周内（24h-48 h最佳）进行脱钙包埋冰冻切片染色。室温固定数小时就会影响酶活，2-8℃固定超过一周也会影响酶活，导致阳性减弱甚至丢失。 4. 做ALP染色的骨组织需要使用本试剂盒中的脱钙液或单独采购我司G1105 EDTA脱钙液4℃低温脱钙（推荐使用我司SDH-10脱钙仪进行2-8℃低温脱钙）。其它脱钙液脱钙的组织，不保证染色结果。用酸性脱钙液脱钙的骨组织，酶失活阳性丢失。建议在我司进行骨组织的脱钙冰冻切片和染色全套实验服务。 5. ALP碱性磷酸酶染色生成的产物易溶于有机试剂，需使用水溶性甘油明胶封片剂（G1402）封片。 6. 由于高温（尤其是超过60℃）对ALP酶活有很大影响，建议脱钙后的骨组织进行冰冻切片后染色，不建议做石蜡切片染色。 参考图片 ALP染色-小鼠膝关节（冰冻切片） 试剂配制参考图片 产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ （产品包装升级中，以实物为准。 ）