规格 荧光双重染色试剂盒 G1225-100T 100T 产品简介 本产品荧光双重染色试剂盒，适用于石蜡切片免疫荧光双重染色，尤其适用和解决一抗为相同来源的荧光双重染色的问题，也可用于不同来源抗体的双染。其主要原理是利用酪酰胺信号放大（TSA）技术，在HRP的作用下，荧光素标记的信号增强剂能够与抗原的酪氨酸残基直接结合，通过微波处理去除结合的一抗二抗，但不会影响荧光素标记的增强剂与抗原的结合，因此不会与后续加入的一抗二抗发生交叉反应，从根本上解决了荧光同源双标串色的问题。此外还能够放大阳性信号，提高低丰度蛋白的检测效果。 储存与运输 冰袋（wet ice）运输； 4℃避光保存，有效期6个月。 组成 Component Number Component G G1225-1 A液：信号增强剂（FITC标记） 50 μL G1225-2 B液：信号增强剂（CY3标记） 50 μL G1225-3 C液：稀释液 20 mL G1225-4 D液：封闭液1 20 mL G1225-5 E液：封闭液2 20 mL G1225-6 F液：DAPI 20 mL G1225-7 G液：自发荧光淬灭剂 20 mL G1225-8 H液：抗荧光淬灭封片剂 20 mL 说明书 1份 操作步骤 第一抗体孵育： 1. 脱蜡、水化组织切片； 2. 根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行抗原修复； 3. PBS洗3次，每次5分钟； 4. 加入100μL D液孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色； 5. PBS洗3次，每次5分钟，组化笔画圈； 6. 加入100μL E液孵育30分钟来减少非特异性染色（血清封闭）； 7. 甩掉E液，加第一个一抗（一抗浓度按照抗体说明书建议浓度降低5-10倍配制，配制好的一抗工作液置于离心机中12000转离心5分钟，滴加一抗时，吸取上层的，底部的30μL舍弃不用），避光湿盒4℃过夜孵育； 8. PBS洗3次，每次5分钟； 9. 加入配制的HRP标记二抗（针对第一个一抗），室温孵育50分钟； 10. PBS洗3次，每次5分钟； 11. 加入100 μL用C液稀释的信号增强剂A或者B工作液（A液或B液：C液=1：500。 配制好的信号增强剂工作液，至于12000转离心5分钟，吸取上层的，底部30 μL舍弃不用），避光湿盒室温孵育10分钟； 12. PBS洗3次，每次5分钟； 第二抗体孵育： 1. 超纯水洗2次，每次5分钟； 2. 将切片放入盛有抗原修复液的修复盒内进行微波处理，维持95℃以上温度15分钟，自然冷却至室温； 3. PBS洗3次，每次5分钟； 4. 加入100μL E液孵育10分钟； 5. 甩掉E液，加第二个一抗（一抗浓度按照抗体说明书建议浓度降低5-10倍配制，配制好的一抗工作液置于离心机中12000转离心5分钟，滴加一抗时，吸取上层的，底部的30μL舍弃不用），避光湿盒4℃过夜孵育； 6. PBS洗3次，每次5分钟； 7. 加入配制的HRP标记二抗（针对第二抗体的），室温孵育50分钟； 8. PBS洗3次，每次5分钟； 9. 加入100μL用C液稀释的信号增强剂B或者A工作液（A液或B液：C液=1：500。 配制好的信号增强剂工作液，至于12000转离心5分钟，吸取上层的，底部30 μL舍弃不用）室温孵育10分钟； 10. PBS洗3次，每次5分钟； 11. 加入100μL F液DAPI染核，室温孵育5分钟； 12. 超纯水冲洗，加入100μL G液，孵育5分钟，淬灭组织自发荧光； 13. 流水冲洗20分钟（勿正对组织）； 14. 滴加100μL H液，50mm×50mm盖玻片封片。 注意事项 1. 实验操作应避光进行（暗环境），操作过程中避免组织干片； 2. 试剂现配现用，PBS洗涤要充分，减少非特异性着色； 3. 一抗浓度按说明书推荐浓度降低5-10倍稀释； 4. 先孵育多抗，后孵育单抗；先孵育低丰度目的蛋白对应的抗体，再孵育高丰度目的蛋白对应的抗体 。 分类 可能原因 优化方案 无阳性信号 抗体效价低 安排对照实验，确认一抗二抗效果 抗原修复偏弱 提高抗原修复强度 阳性信号弱 抗体浓度低 提高一抗浓度 抗原修复偏弱 提高抗原修复强度 增强剂孵育时间短 延长增强剂的孵育时间 非特异性着色多 抗体浓度过高 降低抗体浓度 增强剂孵育时间过长 缩短增强剂的孵育时间 封闭效果不佳 延长试剂D，E的孵育时间 产品仅供科研用途，不用于临床诊断！ 图例： 大鼠脑NEUN（绿光）+MBP(红光) H睾丸癌CD68（绿光）+CD8（红光） 大鼠脑GFAP（绿光）+NEUN（红光） H肾α-SMA（绿光）+CD31（红光）