服务介绍： 抗原抗体的结合非常特异。 免疫荧光单标 是用与目标蛋白对应的特异性的第一抗体去孵育组织切片，然后再利用对应的带有荧光染料的第二抗体与第一抗体结合，在组织切片扫描仪或者荧光显微镜下用荧光染料对应波长的光去激发染料发出荧光进而将目标蛋白通过间接标记的方式显示出来。也可以利用TSA技术进行荧光标记，有信号放大的作用。 TSA技术 主要原理为 用HRP标记的第二抗体与第一抗体结合后，再孵育 荧光标记的酪胺 （ TSA ）， TSA 在二抗上偶联的HRP与H 2 O 2 的作用下变为活化的酪胺并附着在 目标蛋白 周围的蛋白酪氨酸残基上， 在组织切片扫描仪或者荧光显微镜下用荧光染料对应波长的光去激发染料发出荧光进而将目标蛋白通过间接标记的方式显示出来。利用TSA技术也可进行多种蛋白同时标记，每轮标记都按一抗-二抗-TSA的顺序对相应抗原进行标记，每轮染色只需改变TSA荧光染料种类即可实现多个靶标用不同荧光染料进行共同标记。 切片数字扫描是通过控制显微成像系统和切片以一定的规则运动，采集多张连续的高分辨率显微图像再无缝拼接生成一张高分辨率的组织切片全景图像。该图像包含了玻片上所有的信息，可在电脑上用浏览软件任意放大和缩小，任意部位观察采图，是真正脱离显微镜的阅片方式。通过在扫描仪上加载与免疫标记时荧光染料匹配的最佳激发波长和发射波长的滤光块，获取不同荧光通道的图像。可单通道，多通道任意组合浏览并按需采图。 扫描的荧光图像可以用软件对阳性信号进行半定量分析，用数据去评价阳性的强弱。对于阳性为单个细胞表达的指标可以做阳性细胞相关参数的分析，对于阳性为成片表达的指标可以做阳性面积相关参数的分析。阳性细胞数量相关参数包含：各指标阳性细胞比率、阳性细胞密度、阳性强度。一次分析即可获取各指标阳性细胞数量相关参数的三个数值。阳性细胞数量相关参数均可用于评价阳性强弱多少，可根据需求进行选择应用。阳性面积相关参数包含：阳性面积比，阳性强度。一次分析即可获取各指标阳性面积相关参数的两个数值。阳性面积相关参数均可用于评价阳性强弱多少，可根据需求进行选择应用。 货号 名称 规格 GDP2146 免疫荧光单标双色扫描分析全套（切片） （包含免疫荧光染色、扫描和分析） 张 送样运输要求： 1、 组织样本放置于10倍样本体积的通用型组织固定液中固定24h以上（推荐使用货号 G1101-15ML ），常温保存运输石蜡包埋切片 或者冰冻切片 。 置于固定液内的组织 切勿冷冻结冰，切勿固定时间过长。 细胞爬片用 通用型组织固定液 （ G1101 ） 固定，封口膜封好防止漏液，常温保存运输。 2、 石蜡切片常温保存运输。 冰冻切片-20° 保存运输 。 实验大体流程： 荧光二抗法： 石蜡切片脱蜡至水（冰冻切片和细胞爬片无需此步）——微波抗原修复——画圈血清封闭——孵育一抗——孵育荧光二抗（可根据需求选择不同荧光染料标记的二抗）——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像 ——数据分析 。 TSA法 石蜡切片脱蜡至水 （ 冰冻切片和细胞爬片无需此步 ） ——微波抗原修复——画圈双氧水封闭——血清封闭——孵育一抗——孵育HRP二抗——孵育TSA （ 可根据需求选择不同荧光染料标记的TSA ）—— DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像 —— 数据分析 。 荧光二抗法 实验具体流程： 1、石蜡切片脱蜡至水： 依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液（ G1128 ）I 10min-环保型脱蜡液（ G1128 ）II 10min-环保型脱蜡液（ G1128 ）III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。 2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（ G1202 PH 6.0 柠檬酸； G1203 PH 9.0 EDTA； G1206 PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒（ WGXFHA0008 ）中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定，优先推荐 G1202 PH 6.0 柠檬酸修复液）。 3 、 画圈 血清封闭 ： 切片稍甩干后用免疫组化笔（ G6100 ）在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于透明湿盒（ SIB-20U ）滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭（ G1209 ），一抗其它来源的用3%BSA( GC305006) 封闭。 4 、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS（ G4250 ）按一定比例配好的一抗，切片平放于透明湿盒（ SIB-20U ）内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。 5 、加对应种属 荧光素 标记 的 二抗 （ 常用iF488标记的二抗或CY3标记的二抗 ） ：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒（ SIB-20U ）在圈内滴加与一抗相应种属的 荧光素 标记的二抗（ GB2 5 404 ； GB2 5 303 ； GB2 5 301 ； GB2 1 404 ； GB2 1 403 等 ）覆盖组织，室温孵育50min。 6 、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）在圈内滴加DAPI染液( G1012 )，避光室温孵育10min。将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。 7 、自发荧光淬灭：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）在圈内加入自发荧光淬灭剂（ G1221 ）5min，流水冲洗10min。 8 、封片：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂（ G1401 ）封片。 9 、镜检成像：切片置于玻片数字扫描仪下扫描全景成像。各种荧光素颜色及激发与发射波长见下表。 10、数据分析：用软件对阳性细胞数量或阳性面积进行分析，得到阳性细胞比率、阳性细胞密度、阳性强度或阳性面积比和阳性强度。 TSA法 实验具体流程： 1、石蜡切片脱蜡至水： 依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液（ G1128 ）I 10min-环保型脱蜡液（ G1128 ）II 10min-环保型脱蜡液（ G1128 ）III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。 2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（ G1202 PH 6.0 柠檬酸； G1203 PH 9.0 EDTA； G1206 PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒（ WGXFHA0008 ）中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC...