服务 介绍： 免疫荧光七标即利用 酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification） 即 TSA技术 ， 在同一张切片上对七种蛋白同时进行标记，从而可实现对多种蛋白空间定位，定性及半定量分析。 TSA技术 主要原理 为荧光标记的酪胺在二抗上偶联的HRP与H 2 O 2 的作用下变为活化的酪胺并附着在靶标周围的蛋白酪氨酸残基上，此结合是共价结合。而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合。 通过抗体洗脱液 处理，非共价结合的一抗二抗被洗脱掉，而共价结合的荧光酪胺依然附着在靶标周围，将靶标通过荧光标记显示出来。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与第一轮的抗体产生交叉反应。只需改变不同种类荧光染料标记TSA即可实现多个靶标的标记。 通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现 双 重 或多重 荧光染色 。 货号 名称 规格 GP2181 免疫荧光 七 标八色（切片） 张 送样运输要求： 1、 石蜡切片常温保存运输，冰冻切片﹣20℃保存运输 2、 细胞爬片PFA固定15min后用无菌PBS（ G4202 ）洗涤 ， 无菌PBS（ G4202 ）浸泡，4℃冰袋保存运输到实验室 实验大体流程： 石蜡切片脱蜡至水——微波抗原修复——画圈双氧水封闭——血清封闭——孵育第一种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第二种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第三种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第四种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第五种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第六种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第七种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。 （TSA荧光染料的搭配及加样顺序根据各抗体的表达情况来确定。） 实验 具体 流程： 1、石蜡切片脱蜡至水： 依次将 石蜡 切片放入 环保型脱蜡液（ G1128 ）I 1 0 min- 环保型脱蜡液（ G1128 ）II 1 0 min- 环保型脱蜡液（ G1128 ）III 1 0 min-无水乙醇Ⅰ 5 min-无水乙醇Ⅱ 5 min-无水乙醇Ⅲ 5 min-蒸馏水洗 。 2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（ G1202 PH 6.0 柠檬酸； G1203 PH 9.0 EDTA； G1206 PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒（ WGXFHA0008 ）中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定，优先推荐 G1202 PH 6.0 柠檬酸修复液）。 3、画圈, 双氧水封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔（ G6100 ）在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）滴加3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min左右，封闭内源性过氧化物酶。将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。 4、血清封闭:切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭（ G1209 ），一抗其它来源的用3%BSA( GC305006 ) 封闭。 5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS（ G4250 ）按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。 6、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒（ SIB-20U ）在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗（ GB23204 ； GB23301 ； GB23302 ； GB23303 ； GB23404 ）覆盖组织，室温孵育50min。 7、加对应的 TSA ：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）在圈内滴加对应的TSA（ G1250 ），避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST（ G0004 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。 至此步骤，第一支抗体标记完成。 8、抗体洗脱： 切片稍甩干后 ， 滴加 抗体洗脱液 （ G1266 ） 铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST（ G2150 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。 9、血清封闭:切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭（ G1209 ），一抗其它来源的用3%BSA( GC305006 ) 封闭。 10、加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS（ G4250 ）按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。 11、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗（ GB23204 ； GB23301 ； GB23302 ； GB23303 ； GB23404 ）覆盖组织，室温孵育50min。 12、加对应的 TSA ：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）在圈内滴加对应的TSA（ G1231 ），避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST（ G0004 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。 至此步骤，第二支抗体标记完成。 备注：步骤4-7为 第 一 支 抗体标记过程， 步骤8-12为第二支抗体标记过程， 每轮抗体标记只需更换不同荧光素标记的TSA 。 每标记完一支抗体 ， 进行抗体洗脱， 去除此轮标记的一抗，二抗后 ， 再 继续下一轮的抗体标记过程。根据荧光多标 的 抗体数量，重复 以上步骤 ，直至完成所有的抗体标记 ， 再进入后续染核，淬灭自发荧光的步骤。 13 、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）在圈内滴加DAPI染液( G1012 )，避...