服务 介绍： 免疫荧光九标即利用 酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification） 即 TSA技术 ， 在同一张切片上对九种蛋白同时进行标记，从而可实现对多种蛋白空间定位，定性及半定量分析。 TSA技术 主要原理 为荧光标记的酪胺在二抗上偶联的HRP与H 2 O 2 的作用下变为活化的酪胺并附着在靶标周围的蛋白酪氨酸残基上，此结合是共价结合。而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合。 通过抗体洗脱液 处理，非共价结合的一抗二抗被洗脱掉，而共价结合的荧光酪胺依然附着在靶标周围，将靶标通过荧光标记显示出来。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与第一轮的抗体产生交叉反应。只需改变不同种类荧光染料标记TSA即可实现多个靶标的标记。 通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现 双 重 或多重 荧光染色 。 货号 名称 规格 GP2186 免疫荧光九标十色（双宽玻片） 张 送样运输要求： 1、 石蜡切片常温保存运输，冰冻切片﹣20℃保存运输 2、 细胞爬片PFA固定15min后用无菌PBS（ G4202 ）洗涤 ， 无菌PBS（ G4202 ）浸泡，4℃冰袋保存运输到实验室 实验大体流程： 石蜡切片脱蜡至水——微波抗原修复——画圈双氧水封闭——血清封闭——孵育第一种一抗 ——孵育HRP二抗—— 孵育 对应的 TSA—— 抗体洗脱 ——血清封闭——孵育第二种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育 对应的 TSA—— 抗体洗脱 ——血清封闭——孵育第三种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育 对应的 TSA—— 抗体洗脱 ——血清封闭——孵育第四种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育 对应的 TSA—— 抗体洗脱 ——血清封闭——孵育第五种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育 对应的 TSA—— 抗体洗脱 ——血清封闭——孵育第六种一抗 ——孵育HRP二抗——孵育 对应的 TSA—— 抗体洗脱 ——血清封闭——孵育第 七 种 一抗 ——孵育HRP二抗——孵育 对应的 TSA—— 抗体洗脱 ——血清封闭——孵育第 八 种 一抗 ——孵育HRP二抗——孵育 对应的 TSA—— 抗体洗脱 ——血清封闭——孵育第 九 种 一抗 ——孵育HRP二抗——孵育 对应的 TSA——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。 （TSA荧光染料的搭配及加样顺序根据各抗体的表达情况来确定。） 实验 具体 流程： 1、石蜡切片脱蜡至水： 依次将 石蜡 切片放入 环保型脱蜡液（ G1128 ）I 1 0 min- 环保型脱蜡液（ G1128 ）II 1 0 min- 环保型脱蜡液（ G1128 ）III 1 0 min-无水乙醇Ⅰ 5 min-无水乙醇Ⅱ 5 min-无水乙醇Ⅲ 5 min-蒸馏水洗 。 2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（ G1202 PH 6.0 柠檬酸； G1203 PH 9.0 EDTA； G1206 PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒（ WGXFHA0008 ）中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定，优先推荐 G1202 PH 6.0 柠檬酸修复液）。 3、画圈, 双氧水封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔（ G6100 ）在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）滴加3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min左右，封闭内源性过氧化物酶。将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。 4、血清封闭:切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭（ G1209 ），一抗其它来源的用3%BSA( GC305006 ) 封闭。 5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS（ G4250 ）按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。 6、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒（ SIB-20U ）在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗（G23204；G23301；G23302；G23303；G23404）覆盖组织，室温孵育50min。 7、加对应的 TSA ：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）在圈内滴加对应的TSA（ G1250 ），避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST（ G0004 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。 至此步骤，第一支抗体标记完成。 8、抗体洗脱： 切片稍甩干后 ， 滴加 抗体洗脱液 （ G1266 ） 铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST（ G2150 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。 9、血清封闭:切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭（ G1209 ），一抗其它来源的用3%BSA( GC305006 ) 封闭。 10、加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS（ G4250 ）按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。 11、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗（G23204；G23301；G23302；G23303；G23404）覆盖组织，室温孵育50min。 12、加对应的 TSA ：将玻片置于PH7.4 PBS（ G0002 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒（ SIB-20F ）在圈内滴加对应的TSA（ G1231 ），避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST（ G0004 ）中在钟摆摇床（ SYC-Z100 ）上晃动洗涤3次，每次5min。 至此步骤，第二支抗体标记完成。 备注：步骤4-7为 第 一 支 抗体标记过程， 步骤8-12为第二支抗体标记过程， 每轮抗体标记只需更换不同荧光素标记的TSA 。 每标记完一支抗体 ， 进行抗体洗脱， 去除此轮标记的一抗，二抗后 ， 再 继续下一轮的抗体标记过程。根据荧光多标 的 抗体数量，重复 以上步骤 ，...