产品信息

产品简介

本试剂盒基于超顺磁性磁珠对核酸的可逆吸附作用被设计用于从100 µL-1 mL的血清/血浆、500 µL-4 mL细胞培养上清、500 µL-4 mL尿液等无细胞样本纯化的外泌体中分离RNA，包括非编码RNA、mRNA、miRNA以及其他小RNA。纯化外泌体时，必须事先通过过滤或离心去除样品中残留的细胞、细胞碎片和凋亡小体。本试剂盒无需苯酚、氯仿等有机试剂。分离得到的产物可用于RT-qPCR、微阵列分析和RNA-seq等下游相关实验。

储存与运输

DNase，DTT Solution冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其余试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。

组成

使用前须知（请仔细阅读）

1. Buffer MEL如有沉淀现象，请于37℃加热溶解，待恢复至室温后使用。

2. 操作前请向Buffer MEL加入DTT Solution，至终浓度为4%，即1 mL Buffer MEL加入40 µL DTT Solution。此裂解液最好现配现用，加入DTT Solution的Buffer MEL可在4℃放置一个月。

3. 使用前请向Buffer RW1中加入22 mL无水乙醇，混匀后使用。

4. 使用前请向Buffer RW2中加入84 mL无水乙醇，混匀后使用。

5. 按照提取样本量提前配制60%异丙醇（现配现用）。

6. 自备磁力架。

操作步骤

纯化小片段外泌体RNA：

1. 用1×PBS（pH 7.4）重悬外泌体颗粒，至总体积为200 µL；

2. 向离心管中加入800 μL Buffer MEL（使用前请确认已加入DTT Solution），涡旋振荡混匀，室温孵育10 min；

3. 将步骤2混合液转移至5 mL或15 mL Nuclease-free离心管中；

4. 向离心管中加入2.25倍体积无水乙醇（即200 μL外泌体样品加入2.25 mL无水乙醇），使用移液器吹打或涡旋振荡混匀，再加入20 μL SweMag Beads（SweMag Beads使用前需充分振荡至分散均匀），使用移液器吹打或涡旋振荡混匀；

5. 室温静置10 min，期间使用移液器或涡旋仪混匀2-3次，使磁珠处于悬浮状态；

6. 将1.5 mL Nuclease-free空离心管固定到磁力架上，用移液器将步骤5溶液转移到固定在磁力架上的空离心管中，待上清清澈后，吸弃上清，请按同样方法将混合液分多次磁吸，直至所有的混合液磁吸完毕；

7. 加入500 μL Buffer RW1（使用前请确认已加入无水乙醇），移开磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清；

8. 加入600 μL Buffer RW2（使用前请确认已加入无水乙醇），移开磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清；

9. 移去磁力架，进行DNase消化：

a）DNase工作液配制：取10 μL 10×DNase Buffer，10 μL DNase，80 μL Nuclease-free Water于新的1.5 mL Nuclease-free离心管中混匀；

b）向有磁珠的离心管中加入100 μL DNase工作液，使用移液器轻轻吹打至磁珠分散均匀，室温放置15 min，期间每5 min使用移液器混匀一次；

10. 消化结束后加入600 μL Buffer RW2（使用前请确认已加入无水乙醇），使用移液器吹打或涡旋振荡至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清；

11. 重复步骤10；

12. 将离心管盖打开，室温放置5-10 min，使乙醇完全挥发（避免磁珠过度干燥，以免影响核酸得率）；

13. 移去磁力架，向离心管中加入30-50 μL Nuclease-free Water，使用移液器轻轻吹打至磁珠分散均匀，室温静置5 min（如果管壁残留较多磁珠，可将离心管瞬时离心，收集管壁磁珠于管底）；

14. 将离心管置于磁力架上，直至磁珠完全吸附，吸取上清至一新的1.5 mL Nuclease-free 离心管中，即得高纯度的外泌体RNA。

纯化大片段外泌体RNA：

1. 用1×PBS（pH 7.4）重悬外泌体颗粒，至总体积为200 µL，将重悬的外泌体颗粒转移至2 mL Nuclease-free离心管中（方便后续试剂加入）；

2. 向离心管中加入800 μL Buffer MEL（使用前请确认已加入DTT Solution），涡旋振荡混匀，室温孵育10 min；

3. 向离心管中加入0.66倍体积60%异丙醇（即200 μL外泌体样品加入660 μL 60%异丙醇），使用移液器吹打或涡旋振荡混匀，再加入20 μL SweMag Beads（SweMag Beads使用前需充分振荡至分散均匀），使用移液器吹打或涡旋振荡混匀；

4. 室温静置10 min，期间使用移液器或涡旋仪混匀2-3次，使磁珠处于悬浮状态；

5. 将离心管移至磁力架上静置30 s，直至磁珠完全吸附，将离心管随磁力架温和地上下颠倒数次，使管壁残留的磁珠冲刷下来，待上清清澈后，吸弃上清；

6. 加入500 μL Buffer RW1（使用前请确认已加入无水乙醇），移开磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清；

7. 加入600 μL Buffer RW2（使用前请确认已加入无水乙醇），移开磁力架，使用移液器吹打至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清；

8. 移去磁力架，进行DNase消化：

a）DNase工作液配制：取10 μL 10×DNase Buffer，10 μL DNase，80 μL Nuclease-free Water于新的1.5 mL Nuclease-free离心管中混匀；

b）向有磁珠的离心管中加入100 μL DNase工作液，使用移液器轻轻吹打至磁珠分散均匀，室温放置15 min，期间每5 min使用移液器混匀一次；

9. 消化结束后加入600 μL Buffer RW2（使用前请确认已加入无水乙醇），使用移液器吹打或涡旋振荡至磁珠分散均匀，将离心管移至磁力架上静置30 s，待上清清澈后，吸弃上清；

10. 重复步骤9；

11. 将离心管盖打开，室温放置5-10 min，使乙醇完全挥发（避免磁珠过度干燥，以免影响核酸得率）；

12. 移去磁力架，向离心管中加入30-50 μL Nuclease-free Water，使用移液器轻轻吹打至磁珠分散均匀，室温静置5 min（如果管壁残留较多磁珠，可将离心管瞬时离心，收集管壁磁珠于管底）；

13. 将离心管置于磁力架上，直至磁珠完全吸附，吸取上清至一新的1.5 mL Nuclease-free离心管中，即得高纯度的外泌体RNA。

注意事项

1. 样品应避免反复冻融，长期保存可置于-80℃冷冻保存。

2. 磁珠悬液在保存过程中应避免冷冻；磁珠易沉降，使用前应充分振荡使其保持均匀悬浮状态。

3. 分离得到的RNA浓度太低，无法通过OD测量进行准确定量。

4. 尽量使用早上第一次的尿液，通常比当天晚些时候收集的尿液浓缩的外泌体多。

5. 向样本中加入磁珠前，需要将样本中的试剂混合均匀。

6. 始终佩戴实验手套，并经常更换。它们会保护你免受试剂的伤害，也会保护RNA免受皮肤上存在的核酸酶的伤害。使用不含RNase的移液枪头和管来处理试剂盒试剂。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）