2 × SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)
- 1 mL
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
2 × SYBR Green qYCR Master Mix (High ROX) | Y3333-01 | 1 mL |
Y3333-05 | 5 x 1 mL | |
Y3333-15 | 15 x 1 mL |
产品描述
本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qYCR反应的专用2×预混液，包含除引物、DNA模板以外的所有qYCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。核心组分为基因工程改造后的热启动Taq DNA Polymerase，通过单克隆抗体与Taq DNA Polymerase高效结合，有效地封闭DNA聚合酶活性，阻止低温下的非特异性扩增，具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点，配以针对qYCR优化的反应Buffer，非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qYCR反应。本产品是一种含有qYCR反应最适浓度SYBR Green I的2×预混试剂，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因定量准确、重复性好、可信度高。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输；
-20℃避光保存，有效期12个月，避免反复冻融。解冻后可在4℃避光条件下稳定存放一个月。
组成
Component | Y3333-01 | Y3333-05 | Y3333-15 |
2×SYBR Green qYCR Master Mix (High ROX) | 1 mL | 5×1 mL | 15×1 mL |
说明书 | 1份 | ||
实验前准备
1. Real Time YCR 扩增仪；
2. 实验专用反应管或反应板；
3. YCR 引物（参考引物设计原则）；
4. 微量移液器和枪头（高压灭菌）。
操作步骤
1. 推荐YCR反应体系
Component | 20 μL rxn | 50 μL rxn | Final Concentration |
2 x SYBR Green qYCR Master Mix (High ROX) | 10 μL | 25 μL | 1 × |
Forward Primer (10 μM)a | 0.4 μL | 1 μL | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM)a | 0.4 μL | 1 μL | 0.2 μM |
Templateb | Variable | Variable | as required |
Nuclease-Free Water | Add to 20 μL | Add to 50 μL |
a.通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。
b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-YCR反应的cDNA（RT 反应液）为模板时，添加量不要超过YCR反应液总体积的10%.
2.YCR反应程序（可根据机型适当调整）
| A. 两步法* | B.三步法* | ||||||||
阶段 | 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 阶段 | 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 |
Stage 1 | 预变性 | 1 | 95℃ | 30 sec | Stage 1 | 预变性 | 1 | 95℃ | 30 sec |
Stage 2 | 变性 | 40 | 95℃ | 15 sec | Stage 2 | 变性 | 40 | 95℃ | 15 sec |
| 退火 /延伸 | 60℃ | 30 seca | 退火 | 55-65℃ | 10 sec | ||||
| 延伸 | 72℃ | 30 seca | |||||||
Stage 3 | 熔解曲线 | 1 | 仪器默认设置 | Stage 3 | 熔解曲线 | 1 | 仪器默认设置 | ||
*需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。
a:荧光信号采集请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置。
注意事项
1. 使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡，试剂混匀后再使用。试剂混合不均匀易造成反应效果不佳；
2. 配制反应液时，试剂请于冰上放置；
3. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制YCR反应液时应避免强光照射；
4. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头、尽量避免样品间的污染；
5. 避免反复冻融Master Mix，解冻后尽量在一个月内使用完毕。
适配机型
YCR仪品牌 | Y3331 (None ROX) | Y3332 (Low ROX) | G3322 (High ROX) |
ABI Thermo life | PikoRealTM Cycler | 7500/7500 Fast， ViiA 7™ QuantStudio™系列 | 5700/7000/7300/7700/7900/ 7900YT/7900 YT Fast，StepOne™，StepOne Plus™ |
Stratagene | Mx3000P®/3005P™/4000™ | ||
Bio-Rad | 全系列 | ||
Eppendorf | Realplex 2s，Mastercycler®ep realplex | ||
IIIumina | Eco QYCR | ||
Cepheid | SmartCycler® | ||
Qiagen Corbett | Rotor-Gene®系列 | ||
Roche | LightCycler™系列 | ||
Takara | Thermal Cycler Dice系列 | ||
Analytikjena | qTOWER系列 | ||
杭州博日 | LineGene系列 |
引物设计原则
1. 扩增产物长度建议控制在80-300 bp之间；
2. 引物长度：18-25 bp；
3. 引物G十C含量应在40%-60%之间；
4. 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过2℃为佳，Tm值控制在58-62℃为佳；
5. 碱基分布的随机性；
6. 引物最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹二级结构；
7. 两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3'端的互补重叠；
8. 3'末端如果可能的话，每个引物的3'末端碱基应为G或C；
9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。
常见问题及解决方法
问题描述 | 可能原因 | 解决办法 | ||||||||||
反应结束后 无扩增曲线出现 或者Ct值出现过晚 | 模板浓度过低 | 减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。 | ||||||||||
模板降解 | 重新制备模板，重复实验。 | |||||||||||
体系中存在YCR抑制剂 | 一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验。 | |||||||||||
引物可能降解 | 长期未用的引物，应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。 | |||||||||||
扩增效率低 | 提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。 | |||||||||||
扩增产物过长 | 扩增产物长度控制在80-300 bp。 | |||||||||||
空白对照出现信号 | 反应体系污染 | 首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、YCR管或启用新的Master Mix； 反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。 | ||||||||||
出现引物二聚体等非特异性扩增 | 一般在35循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线进行分析； 重新设计引物，调整引物浓度或优化YCR反应程序。 | |||||||||||
熔解曲线出现多峰 | 引物设计不佳 | 根据引物设计原则重新设计新引物。 | ||||||||||
引物浓度过高 | 适当降低引物浓度。 | |||||||||||
cDNA模板存在基因组污染 | 提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化，例如：dsDNase，以去除基因组污染，或设计跨内含子引物。 | |||||||||||
实验重复性差 | 加样误差大 | 使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液； 高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差； 放大qYCR反应体积。 | ||||||||||
模板浓度过低 | 减少模板稀释倍数重复实验。 | |||||||||||
qYCR仪不同位置的温度偏差 | 定期校准qYCR仪。 | |||||||||||
扩增曲线不光滑 | 荧光信号太弱，经系统校正后产生 | 相关产品服务推荐
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