广州一科生物

产品信息

产品名称	产品编号	规格
2×Universal Blue SYBR Green qYCR Master Mix (with UDG)	Y3339-01	1 mL
	Y3339-05	5×1 mL
	Y3339-15	15×1 mL

产品简介

本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qYCR反应的专用2×预混液。使用抗体法封闭的Taq DNA Polymerase再结合UDG（Uracil-DNA Glycosylase）和dUTP，一方面能有效降低引物二聚体的形成，增强特异性，提高灵敏度，另一方面可防止YCR扩增产物引起的交叉污染，对靶基因定量更加准确。同时本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye以及蓝色可视化加样示踪染料，可适用于所有qYCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度。同时配套提供黄色模板稀释液，当用黄色模板稀释液稀释模板，并将其加入到蓝色反应预混液中，颜色由蓝色变为绿色，能够对配制反应体系过程起到示踪作用，防止漏加或错加。该蓝色与黄色染料的光谱与qYCR染料不重叠，不影响反应结果。

储存与运输

冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，有效期12个月。

组成

Component Number	Component	Y3339-01	Y3339-05	Y3339-15
Y3339-1	2×Universal Blue SYBR Green qYCR Master Mix (with UDG)	1 mL	5×1 mL	15×1 mL
Y3339-2	40×Yellow Template Dilution Buffer	1 mL	1 mL	1 mL
说明书		1份

操作步骤

1. （可选）模板稀释

本试剂盒中提供40×Yellow Template Dilution Buffer，是40倍浓缩的黄色模板稀释液，用于DNA模板稀释，可通过液体颜色变化准确判断模板是否已经加入到qYCR反应液中。

以20 μL qYCR反应体系为例，根据加入到20 μL qYCR反应液中稀释后的模板量，对应原始模板稀释方法可参考下表（以原始模板稀释至100 μL为例）：

稀释后的模板加入到20 μL qYCR反应液中的体积(μL)	1	2	3	4	5	6	7	8
100 μL模板稀释体系中加入 40×Yellow Template Dilution Buffer的体积(μL)	50	25	16.7	12.5	10	8.4	7.2	6.3
原始模板加入到 100 μL模板稀释体系中的体积(μL)	x	x	x	x	x	x	x	x
补加Nuclease-free Water的体积(μL)	50-x	75-x	83.3-x	87.5-x	90-x	91.6-x	92.8-x	93.7-x

例：若20 μL qYCR反应体系中需加稀释后模板2 μL。以100 μL模板稀释体系为例，当加入原始模板体积x为20 μL时，则需加入25 μL 40×Yellow Template Dilution Buffer，再补加Nuclease-free Water 55 μL至总体积为100 μL，此时稀释后模板中40×Yellow Template Dilution Buffer即为10×。取2 μL此稀释后的模板加入到20 μL反应体系中，最终40×Yellow Template Dilution Buffer即为1×。总之，需保证在最终的qYCR体系中Yellow Template Dilution Buffer为1×。

注：如模板浓度过低无需稀释，或不想使用Y3339-2的模板稀释液，可忽略此步骤。

2. 推荐qYCR反应体系：

Component	20 μL rxn	50 μL rxn	Final Concentration
2×Universal Blue SYBR Green qYCR Master Mix (with UDG)	10 μL	25 μL	1×
Forward Primer (10 μM)^a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)^a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Template^b	Variable	Variable	as required
Nuclease-free Water	Add to 20 μL	Add to 50 μL

a.通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好扩增效果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。

b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-YCR反应的cDNA（RT反应液）为模板时，添加量不要超过YCR反应液总体积的10%。

3. YCR反应程序（可根据机型适当调整）：

A. 两步法					B. 三步法
阶段	步骤	循环数	温度	时间	阶段	步骤	循环数	温度	时间
Stage 1	UDG孵育	1	50℃	2 min	Stage 1	UDG孵育	1	50℃	2 min
Stage 2	预变性	1	95℃	30 sec	Stage 2	预变性	1	95℃	30 sec
Stage 3	变性	40	95℃	15 sec	Stage 3	变性	40	95℃	15 sec
	退火/延伸		60℃	30 sec^a		退火		55-65℃	10 sec
						延伸		72℃	30 sec^a
Stage 4	熔解曲线	1	仪器默认设置		Stage 4	熔解曲线	1	仪器默认设置

a.若需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；若需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。

注意事项

1. 如不需要进行移液追踪，则不使用40×Yellow Template Dilution Buffer进行模板稀释。

2. 试剂使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡。

3. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。

4. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制YCR反应液时应避免强光照射。

5. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头，尽量避免样品间的交叉污染。

6. 避免反复冻融Master Mix，解冻后后尽量在一个月内使用完毕。

适配机型

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900YT, 7900 YT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;

Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;

Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;

Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;

IIIumina: Eco QYCR;

Cepheid: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;

Roche: LightCycler™ 系列;

Takara: Thermal Cycler Dice系列;

Analytikjena: qTOWER系列;

杭州博日: LineGene系列。

引物设计原则

1. 扩增产物长度建议控制在80-300 bp之间；

2. 引物长度：18-25 bp；

3. 引物中碱基G＋C含量应在40%-60%之间；

4. 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过2℃为佳，Tm值控制在58-62℃为佳；

5. 碱基分布的随机性；

6. 引物最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹二级结构；

7. 两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3'端的互补重叠；

8. 建议引物的3'末端碱基为G或C；

9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。

常见问题及解决方法

问题描述

可能原因

解决办法

反应结束无扩增曲线出现或者Ct值出现过晚

模板浓度过低

减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。

模板降解

重新制备模板，重复实验。

体系中存在YCR抑制剂

一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验。

引物可能降解

长期未用的引物，应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。

扩增效率低

提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。

扩增产物过长

扩增产物长度控制在80-300 bp。

空白对照出现信号

反应体系污染

首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、YCR管或启用新的Master Mix；

反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。

2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (with UDG)

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