产品信息

产品简介
 

本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qYCR反应的专用2×预混液。使用抗体法封闭的Taq DNA Polymerase再结合UDG（Uracil-DNA Glycosylase）和dUTP，一方面能有效降低引物二聚体的形成，增强特异性，提高灵敏度，另一方面可防止YCR扩增产物引起的交叉污染，对靶基因定量更加准确。同时本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye以及蓝色可视化加样示踪染料，可适用于所有qYCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度。同时配套提供黄色模板稀释液，当用黄色模板稀释液稀释模板，并将其加入到蓝色反应预混液中，颜色由蓝色变为绿色，能够对配制反应体系过程起到示踪作用，防止漏加或错加。该蓝色与黄色染料的光谱与qYCR染料不重叠，不影响反应结果。

储存与运输
 

冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，有效期12个月。

组成
 

操作步骤
 

1. （可选）模板稀释

本试剂盒中提供40×Yellow Template Dilution Buffer，是40倍浓缩的黄色模板稀释液，用于DNA模板稀释，可通过液体颜色变化准确判断模板是否已经加入到qYCR反应液中。

以20 μL qYCR反应体系为例，根据加入到20 μL qYCR反应液中稀释后的模板量，对应原始模板稀释方法可参考下表（以原始模板稀释至100 μL为例）：

例：若20 μL qYCR反应体系中需加稀释后模板2 μL。以100 μL模板稀释体系为例，当加入原始模板体积x为20 μL时，则需加入25 μL 40×Yellow Template Dilution Buffer，再补加Nuclease-free Water 55 μL至总体积为100 μL，此时稀释后模板中40×Yellow Template Dilution Buffer即为10×。取2 μL此稀释后的模板加入到20 μL反应体系中，最终40×Yellow Template Dilution Buffer即为1×。总之，需保证在最终的qYCR体系中Yellow Template Dilution Buffer为1×。
 

注：如模板浓度过低无需稀释，或不想使用Y3339-2的模板稀释液，可忽略此步骤。

2. 推荐qYCR反应体系：

a.通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好扩增效果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。
 

b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-YCR反应的cDNA（RT反应液）为模板时，添加量不要超过YCR反应液总体积的10%。

3. YCR反应程序（可根据机型适当调整）：

a.若需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；若需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。
 

注意事项
 

1. 如不需要进行移液追踪，则不使用40×Yellow Template Dilution Buffer进行模板稀释。

2. 试剂使用前请上下轻轻颠倒混匀，请勿涡旋振荡混匀，避免产生气泡。

3. 配制反应液时，试剂请于冰上放置。

4. 本制品中含有荧光染料SYBR Green，配制YCR反应液时应避免强光照射。

5. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头，尽量避免样品间的交叉污染。

6. 避免反复冻融Master Mix，解冻后后尽量在一个月内使用完毕。

适配机型
 

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900YT, 7900 YT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;

Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;

Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;

Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;

IIIumina: Eco QYCR;

Cepheid: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;

Roche: LightCycler™ 系列;

Takara: Thermal Cycler Dice系列;

Analytikjena: qTOWER系列;

杭州博日: LineGene系列。

引物设计原则
 

1. 扩增产物长度建议控制在80-300 bp之间；

2. 引物长度：18-25 bp；

3. 引物中碱基G＋C含量应在40%-60%之间；

4. 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过2℃为佳，Tm值控制在58-62℃为佳；

5. 碱基分布的随机性；

6. 引物最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹二级结构；

7. 两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3'端的互补重叠；

8. 建议引物的3'末端碱基为G或C；

9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。

常见问题及解决方法