产品信息

产品简介

本试剂盒是采用对质粒具有专一吸附作用的玻纤膜，再结合特殊的缓冲Buffer组合，可以有效地从培养的细菌中提取各种无内毒素质粒（内毒素含量≤0.1 EU/μg），根据质粒拷贝数的不同，质粒得量在100-400 μg，提取的高纯度质粒可应用于后续的酶切反应、连接反应、YCR扩增、测序、转化、转染等多种生物学实验。

储存与运输

RNase A冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其余试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。

组成

使用前准备

1. 自备无水乙醇。

2. 准备42℃水浴或加热模块。

3. 使用前先将RNase A全部加入Buffer P1中，并于4℃可保存6个月。

4. Buffer YW使用前加入64 mL的无水乙醇。

5. Buffer P2如出现沉淀，请于37℃水浴中加热几分钟即可恢复澄清，使用后应立即盖紧盖子，避免试剂长时间与空气接触。

6. Buffer P3使用前请于4℃预冷。

实验步骤

1. 柱平衡步骤：向HiBind DNA Midi Column中加入2 mL Buffer BL，4500×g室温离心2 min，弃掉废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回Collection Tube中（处理过的柱子最好立即使用）；

2. 取20-50 mL过夜培养菌液，8000×g室温离心1 min收集菌体于50 mL离心管中（尽量将上清全部去除），低拷贝或大于10 kb的质粒建议适当增大菌体量，并等比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量；

3. 加入2.5 mL Buffer P1（请先确认是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮菌体（务必使菌体彻底分散，否则会影响裂解，导致提取质粒的质量和纯度偏低）；

4. 加入2.5 mL Buffer P2，立即温和地上下颠倒8-10次使菌体充分裂解（此步不可剧烈震荡，避免造成基因组DNA剪切断裂，并且应保证在5 min以内完成），此时溶液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮可能是菌体过多，裂解不彻底，应考虑降低菌体量；

5. 加入2.5 mL Buffer P3（提前4℃预冷）立即温和地上下颠倒10-12次充分混匀，溶液出现紧实凝集块，8000×g室温离心15 min，将上清慢慢地全部倒入Column Filter中，推动推柄过滤，滤液收集于15 mL Nuclease-free离心管（自备）中；

6. 加入750 μL Buffer ER，颠倒混匀后冰上放置10 min（期间颠倒混匀3-5次），溶液呈透明蓝色；

7. 42℃孵育5 min溶液恢复浑浊，4500×g室温离心5 min（离心机温度必须恢复至室温，否则会影响分层），此时溶液分为上下两层（如果分层不明显，室温放置1-3 min），上层为澄清水相，下层为蓝色，小心收集上层水相至新的15 mL Nuclease-free离心管（自备）中;

8. 加入0.5倍上述溶液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后将溶液转移到HiBind DNA Midi Column中（每次加入液体量不超过4 mL）；

9. 4500×g室温离心3 min，弃掉Collection Tube中的废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回Collection Tube中（第8步的溶液需进行多次过柱）；

10. 向吸附柱中加入3.5 mL Buffer ED 4500×g室温离心3 min，弃掉Collection Tube中的废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回Collection Tube中；

11. 向HiBind DNA Midi Column中加入3.5 mL Buffer YW（确认是否加入无水乙醇），4500×g室温离心3 min，弃掉Collection Tube中的废液，将HiBind DNA Midi Column重新放回Collection Tube中；

12. 重复操作步骤11；

13. 4500×g室温离心10 min，然后将HiBind DNA Midi Column置于15 mL Centrifuge Tube中，开盖室温放置10 min，使乙醇彻底挥发；

14. 向HiBind DNA Midi Column的膜中间部位悬空滴加500-1000 μL Buffer TE或Endo-free Water，室温放置5 min，4500×g离心5 min。如果需要增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到HiBind DNA Midi Column中，室温放置5 min后，4500×g离心5 min；

15. 得到的质粒DNA可于-20℃长期保存。

注意事项

1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。

2. 避免直接接触Buffer P2、P3，ED使用后应立即盖紧盖子。

3. 提取的质粒为低拷贝质粒或者质粒大于10 kb时，应增加菌体收集量，同时等比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量。

4. 可将洗脱液于60-65℃预热，并延长洗脱孵育时间，可提高洗脱效率。

5. 洗脱质粒前应使乙醇完全挥发，避免残留的乙醇影响下游实验。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

附操作流程简图

（产品包装升级中，以实物为准。）