产品信息

产品简介

本试剂盒采用经典的碱裂解法和硅胶膜对核酸可逆性结合的方法，可从100 mL过夜培养的大肠杆菌中提取500 µg-1500 µg的质粒DNA。提取的质粒DNA可直接用于酶切反应、连接反应、YCR扩增、测序、转化等各种分子生物学实验。

储存与运输

RNase A冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其他试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。

组成

使用前准备

1. 自备无水乙醇和50 mL Nuclease-free的离心管。

2. 使用前先将RNase A全部加入Buffer P1中，并于2-8℃可保存6个月。

3. 使用前向Buffer PD加入75 mL无水乙醇，向Buffer YW加入163 mL的无水乙醇。

4. Buffer P2如出现沉淀，请于37℃水浴中加热几分钟即可恢复澄清，使用后应立即盖紧盖子，避免试剂长时间与空气接触。

5. Buffer P3使用前请于4℃或冰浴预冷。

实验步骤

1. 柱平衡步骤：向HiBind DNA Column中加入2.5 mL Buffer BL，10,000×g离心2 min，弃掉废液，将HiBind DNA Column重新放回Collection Tube中（处理过的柱子最好当天使用）；

2. 取100 mL过夜培养菌液，10,000×g室温离心1 min收集菌体于50 mL离心管中（尽量将上清全部去除），低拷贝或质粒DNA大于10 kb建议收集200 mL过夜培养的菌体，并等体积的增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量；

3. 加入8 mL Buffer P1（请先检查是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮菌体（务必使菌体彻底分散，否则会影响裂解，导致提取质粒的质量和纯度偏低）；

4. 加入8 mL Buffer P2立即温和的上下颠倒8-10次使菌体充分裂解（此步不可剧烈震荡，避免造成基因组DNA剪切断裂，并且应保证在5 min以内完成），此时溶液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮可能是菌体过多，裂解不彻底，可再次轻轻颠倒5-8次，直到溶液彻底清亮；

5. 加入8 mL Buffer P3（提前4℃预冷），立即温和的上下颠倒10-12次充分混匀，溶液出现紧实凝集块，10,000×g离心10-15 min，将上清慢慢地全部倒入Column Filters中，推动推柄过滤，滤液收集于Nuclease-free的50 mL离心管（自备）中；

6. 加入0.5倍上述溶液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后转移到HiBind DNA Column中（每次加入液体量不超过10 mL）；

7. 室温10,000×g离心2 min，弃掉Collection Tube中的废液，将HiBind DNA Column重新放回Collection Tube中（第6步的溶液需进行多次过柱）；

8. 向吸附柱中加入10 mL Buffer PD（确认是否加入无水乙醇），10,000×g离心2 min，弃掉Collection Tube中的废液，将HiBind DNA Column重新放回Collection Tube中；

9. 向HiBind DNA Column中加入10 mL Buffer YW（确认是否加入无水乙醇）10,000×g离心2 min，弃掉Collection Tube中的废液，将HiBind DNA Column重新放回Collection Tube中；

10. 重复操作步骤9；

11. 10,000×g离心5 min，将HiBind DNA Column置于新的50 mL Collection Tube中开盖室温放置10 min，使乙醇彻底挥发；

12. 向HiBind DNA Column的膜中间部位悬空滴加1-1.5 mL Buffer TE或Nuclease-free Water，室温放置5 min，10,000×g离心5 min。如果需要增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到HiBind DNA Columns中，室温放置5 min后，10,000×g离心5 min；

13. 得到的质粒DNA可于-20℃长期保存。

注意事项

1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。

2. 低拷贝或质粒DNA大于10 kb建议收集200 mL过夜培养的菌体，并等体积的增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的量

3. 可将洗脱液于60-65℃预热，并延长孵育时间，可提高洗脱效率。

4. 洗脱质粒前应使乙醇完全挥发，避免残留的乙醇影响下游实验。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

附操作流程简图

（产品包装升级中，以实物为准。）