产品信息

产品简介

本试剂盒适用于从培养的细菌中提取各种无内毒素的质粒DNA。试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术以及搭配去内毒素溶液Buffer ER和Buffer ED，可得到浓度在500-1800 μg的高纯度质粒DNA，并有效地去除内毒素。使用本试剂盒提取的质粒DNA可应用于酶切反应、连接反应、YCR扩增、测序、转化、转染多种细胞等生物学实验。

储存与运输

RNase A冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其余试剂室温运输，室温储存；有效期12个月。

组成

使用前准备

1. 自备无水乙醇和50 mL Nuclease-free的离心管。

2. 使用前先将RNase A全部加入Buffer P1中，并于4℃可保存6个月。

3. Buffer YW使用前加入163 mL的无水乙醇。

4. Buffer P2如出现沉淀，请于37℃水浴中加热几分钟即可恢复澄清，使用后应立即盖紧盖子，避免试剂长时间与空气接触。

5. Buffer P3使用前请于4℃预冷。

实验步骤

1. 柱平衡步骤：向HiBind DNA Column中（HiBind DNA Column提前放入50 mL Collection Tube中）加入2.5 mL Buffer BL，8000 rpm（～8228×g）室温离心2 min，弃掉废液，将HiBind DNA Column重新放回Collection Tube中（处理过的柱子最好立即使用）；

2. 取100 mL过夜培养菌液（对于低拷贝质粒建议取200 mL过夜培养菌液），8000 rpm（～8228×g）室温离心3 min收集菌体于50 mL离心管中（尽量将上清全部去除）；

3. 加入8 mL Buffer P1（请先检查是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮菌体（务必使菌体彻底分散，否则会影响裂解，导致提取质粒的质量和纯度偏低）；

4. 加入8 mL Buffer P2立即温和的上下颠倒8-10次使菌体充分裂解（此步不可剧烈震荡，并且应保证在5 min以内完成），此时溶液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮可能是菌体过多，再重新颠倒几次直到溶液透明；

5. 加入8 mL Buffer P3（提前4℃预冷）立即温和的上下颠倒10-12次，溶液出现紧实凝集块，冰上放置5 min，8000 rpm（～8228×g）4℃离心15 min，将上清慢慢地全部倒入Column Filter中，推动推柄过滤，滤液收集于Nuclease-free的50 mL离心管（自备）中；

6. 加入2.4 mL Buffer ER，颠倒混匀后冰上放置10 min（期间颠倒混匀3-5次），溶液呈透明蓝色；

7. 加入0.5倍上述溶液体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后转移到HiBind DNA Column中（每次加入液体量不超过10 mL）；

8. 室温8000 rpm（～8228×g）室温离心2 min，弃掉HiBind DNA Column中的废液，将HiBind DNA Column重新放回Collection Tube中（第七步的溶液可进行多次过柱）；

9. 向吸附柱中加入10 mL Buffer ED 8000 rpm（～8228×g）室温离心2 min，弃掉HiBind DNA Column中的废液，将HiBind DNA Column重新放回Collection Tube中；

10. 向HiBind DNA Column中加入10 mL Buffer YW 8000 rpm（～8228×g）室温离心2 min，弃掉收集管中的废液，将HiBind DNA Column重新放回Collection Tube中；

11. 重复操作步骤10；

12. 8000 rpm（～8228×g）室温离心5 min；

13. 将HiBind DNA Column置于新的50 mL Collection Tube中，开盖室温放置10 min，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2 mL Buffer TE，室温放置5 min，8000 rpm（～8228×g）离心5 min。如果需要增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到HiBind DNA Column中，室温放置5 min后，8000 rpm（～8228×g）离心5 min；

14. 将50 mL Collection Tube中的洗脱液全部移到一个Nuclease-free的1.5 mL离心管中，－20℃保存。

注意事项

1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。

2. 使用Column Filter过滤时请勿加入过多沉淀，以免堵住过滤器。

3. 提取的质粒DNA大于10 kb时，应增加菌体收集量。

4. 洗脱质粒前应使乙醇完全挥发，避免残留的乙醇影响下游实验。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

附操作流程简图

（产品包装升级中，以实物为准。）