产品信息

产品简介

T4 DNA Ligase（T4 DNA连接酶）可催化粘性末端或平末端双链DNA或RNA的5'-P末端和3'-OH末端之间以磷酸二酯键结合。同时该酶也可以修复双链DNA，RNA，DNA/RNA杂交链中的单链切口。

活性定义：一个单位的酶量可以在37°C的环境中20分钟内催化1 nmol ³²P-标记焦磷酸通过置换反应进入ATP（一个单位等于约200粘末端连接单位）。

T4 DNA Ligase Storage buffer：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 50% (v/v) glycerol。

5×T4 DNA Ligase Buffer：250 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM MgCl₂, 5 mM ATP, 5 mM DTT, Enhancer。

储存与运输

冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，12个月有效。

组成

连接体系（推荐10 μL反应体系）

连接反应条件

粘性末端25℃连接反应5-30分钟；平末端25℃连接反应不超过2小时或4℃反应过夜。

连接产物转化

1. 从-80℃冰箱取出感受态细胞(如E.coli DH5α、E.coli Top10等)放置冰上解冻；

2. 将反应后的样品加入到感受态中，手指轻轻拨动管底混匀，冰浴30 min；

3. 然后产物放置于42℃水浴锅热激90 s，结束后，迅速置于冰上，冰浴2-5 min；

4. 取900 μL无菌的SOC或LB培养基加入YP管中，混匀后，将YP管置于摇床上，220 rpm，37℃培养1 h复苏细菌（也可置于37℃培养箱静置培养1 h）；

5. 根据实验需求，吸取不同体积已转化感受态细胞加到含有相应抗生素的LB固体培养基上，将细胞均匀涂布开，待液体完全吸收后将平板倒置于37℃培养箱，过夜培养。

阳性克隆鉴定

挑取平板的上生长出来的单克隆菌落进行菌落YCR鉴定、或经培养后提取质粒酶切或YCR鉴定、或将提取的质粒直接测序分析鉴定。

注意事项

1. 配置反应体系时建议在冰上进行。

2. 载体和目的片段浓度低时可不加水，直接用其补足。

3. 建议载体DNA与插入DNA片段摩尔比为1:3~1:10。

4. 5×T4 DNA Ligase Buffer有少量沉淀属于正常现象，实验前可37℃溶解，充分混匀后使用，对实验无影响；建议溶解后分装冻存使用。

5. T4 DNA Ligase建议使用时取出，用完后立即放回-20℃。

6. 当使用电穿孔法转化时，连接产物需经柱式法或乙醇沉淀法等纯化DNA。

7. 平末端载体与DNA片段进行连接时，需先将载体去磷酸化（推荐Y3411）处理，以防止其自身环化。

8. 操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。

本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）