产品信息

产品简介

SweAgarose SulfoLink 是一类预活化的琼脂糖微球，可以通过与巯基的共价偶联反应实现抗原的固定化，进而对免疫血清中的抗体进行纯化。可以得到高效价的目标抗体，是抗体生产中不可缺少的纯化介质。

产品信息

储存与运输

常温运输；2-8℃保存，有效期12个月。

组成

使用说明：

1. 缓冲液准备：

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.45μm滤膜过滤，推荐一科自产实验室专用纯水（货号：Y4712）；

偶联液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5

封闭液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5

保护液：含20%乙醇的1xPBS

洗杂液：0.15 M NaCl，20 mM Na₂HPO₄，pH 7.0

洗脱液：0.1M 甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

2. 抗原准备：

抗原样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

抗原样品使用前务必确保其巯基处于还原状态(可以使用 Ellman's Reagent 检测自由巯基的含量)。如果巯基已经氧化，必须对抗原样品进行还原，推荐使用还原剂TCEP (Trs(2-carboxyeth)p hosphine)，TCEP可以选择性的、高效的打开二硫键，并且不影响抗原样品与填料的偶联反应，TCEP的添加量可根据具体情况进行优化。若使用DTT等含有巯基的还原剂，则需要将还原剂去除，否则会影响抗原样品与填料的偶联效率。

将抗原样品溶于偶联液中或换液，制备成终浓度为 1 mg/mL 的溶液。建议现配现用，储存时间过长会影响偶联效率。

3. 抗原偶联

下面以多肽为抗原纯化抗体为例

1) 取适量的Sulfolink填料，加入合适的重力层析柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液清洗填料，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9倍体积的偶联液。

2) 关闭柱子的下端出口，加入等体积的含巯基的多肽(用偶联液溶解)，封闭柱子上端，置于28℃震荡解育30 min。（注:确保填料充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率）。

3) 将上述反应体系取出，流干其中溶液，并收集流出，再用3倍柱体积的偶联液清洗填料，合并两次流出。（注:如有需要，可以使用Ellman's Reagent 检测其中巯基含量，得出抗原残留量，从而计算偶联效率）。

4) 关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，封闭柱子上端，置于28℃震荡孵育30 min。

5) 将上述反应体系取出，流干其中的封闭液。

6) 用3倍柱体积的偶联液清洗填料，然后保存在等体积的保护液中，于2-8℃保存。

4. 重力层析柱的装填

1) 取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。

2) 将偶联好的填料混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中，打开下出口流干保护液。

3) 加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。

4) 装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。

5) 装填好的重力柱可以直接加入偶联液进行清洗。

5. 抗体纯化

5.1 孵育法纯化

1) 根据需要纯化的血清量，取适量偶联好的填料加入层析柱中，重力流干保护液。

2) 加入3倍介质体积的洗杂液清洗层析柱中的介质，重力流干。

3) 加入血清，封闭柱管两端，4℃振荡孵育2-4 h 或者37℃孵育30 min-2 h。

4) 孵育结束后，离心或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。

5) 用5倍介质体积的洗杂液洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，离心或过滤去除上清，重复此操作，用G250检测杂蛋白是否清洗干净（吸取过滤后的100μL上清与100μL G250混合，观察G250无明显颜色变化即可），中间建议更换新离心管。

6) 加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，孵育10-15 min，离心或过滤收集洗脱液，可重复2-3次。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议每1ml洗脱组分中加入50μL中和液进行中和。

5.2 重力柱法纯化

1) 将装填好的重力柱用3倍柱体积洗杂液进行清洗，重力流干。

2) 加入1倍柱体积血清，封闭柱管两端，4℃振荡孵育2-4 h 或者37℃孵育30 min-2 h。可以反复上样增加结合效率。重力流出，收集流出液作为流穿。

3) 用10 倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，重力流出，收集洗杂液，用G250检测杂蛋白是否清洗干净（在柱子下端出口吸取100μL流出液与100μL G250混合，观察G250无明显颜色变化即可）可重复此操作，直至完全去除杂蛋白。

4) 用1倍介质体积的洗脱液进行洗脱，关闭下出口，孵育1-2min后，重力流出，收集洗脱液，用G250检测目标抗体是否收集干净（在柱子下端出口吸取100μL流出液与100μL G250混合，观察G250无明显颜色变化即可）。洗脱组分需要立即调成中性，建议每1mL洗脱组分中加入50μL中和液进行中和。重复此操作，直至抗体全部洗脱。

5) 介质洗脱结束后，先用洗杂液冲洗3倍柱体积，然后用纯水冲洗5倍柱体积，再用20%乙醇冲洗2个柱体积，然后将介质置于2-8°保存。

6. SYS-PAGE检测

将使用纯化产品得到的样品 (包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分)以及原始样品使用 SYS-PAGE 检测纯化效果。

注意事项

1. 偶联过程中需要使填料充分悬浮，否则将影响偶联效率。

2. 纯化时填料中不能有气泡，否则会降低柱子流速，可轻轻敲击层析柱去除气泡。

3. 偶联液中如有沉淀，蛋白溶解不充分，可在偶联液中加入小于30%的DMSO或DMF或6M盐酸胍促进溶解。

4. 洗杂或洗脱不干净，可增加洗杂液或洗脱液的体积。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！