成骨细胞的标记酶是碱性磷酸酶（ALP），破骨细胞的标记酶是抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）。通常采用ALP染色来直观反应骨组织中成骨细胞的定位及含量变化；TRAP染色用来评估破骨细胞活性，TRAP染色强度与破骨细胞骨吸收活性呈正相关，可反映骨改建过程中骨吸收速率。两种特异性标志酶（ALP/TRAP）的同时检出，可以分析成骨细胞与破骨细胞的分化及其在骨组织的分布情况。

但常规室温脱钙，长时间脱钙，会导致骨组织中ALP酶不可逆失活，影响成骨细胞定位的染色效果，导致实验失败。推荐使用一科低温脱钙仪（YDH-5）,能持续在4℃低温下脱钙，并且通过优化的脱钙程序，更快的完成脱钙，结合一科经过粘附处理的冰冻载玻片（Y6023-2）能得到清晰有效的ALP-TRAP双重染色结果。

产品信息

产品简介

正常的骨代谢是通过成骨细胞合成骨基质与破骨细胞吸收骨基质而维持平衡。成骨细胞的标记酶是碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）。破骨细胞的标记酶是抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）。这两种标记酶在组织切片或者培养细胞过程中，被作为成骨细胞、破骨细胞存在的标记指标。通过对这两种特异性标志酶（ALP/TRAP）的同时检出，可以分析骨相关细胞的分化及其在骨组织的分布情况。

本实验采用偶氮偶联法来显示碱性磷酸酶（ALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的活性，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使萘酚AS-BI磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色（蓝色）产物，以此证明碱性磷酸酶（ALP）的定位。在酸性条件下，抗酒石酸酸性磷酸酶可使萘酚AS-BI磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色（红色）产物，以此证明抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的定位。骨组织冰冻切片前需经脱钙处理，本染色试剂盒中的ALP+TRAP染色脱钙液经4℃低温脱钙能有效保证ALP+TRAP染色效果。 经本产品染色后，含ALP的成骨细胞呈蓝色，含TRAP的破骨细胞呈红色。按照切片上每片组织300-400 μL的用量，本试剂盒可以做50 T。

储存与运输

染色试剂盒A液和C液-20℃避光保存，其余成分4℃保存，12个月有效期。

组成

脱钙液的使用

取目的部位骨组织用中性通用型组织固定液（Y1112）4℃固定，一周内将骨组织取出经流水冲洗10 min后置于本试剂盒的脱钙液中，于4℃浸泡脱钙（推荐使用我司YDH-10脱钙仪进行4℃低温脱钙），每3天更换一次脱钙液直到脱钙完全。因高温会影响酶活，为保证染色效果，建议脱完钙的骨组织进行冰冻切片后染色，不建议做石蜡切片染色。

染色前准备

配制ALP工作液：

（1）取一支5mg ALP+TRAP双重染色试剂盒A液加入250 μL的超纯水震荡混匀，终浓度为20 mg/mL。

（2）依次取第一步配制的A液稀释液及B液，C液，D液按照1∶25∶1∶0.5的比率进行混合，震荡混匀。

（3）第（2）步的混合液经针式滤器过滤（0.45 μm 水系滤膜，WG4614）即得到ALP工作液。

配制TRAP工作液：

（1）取50 μL E液与50 μL F液在洁净离心管中混匀。

（2）向第（1）步的100 μL混合液中加入100 μL C液，吹吸数次充分混匀。

（3）吸取1.8 mL G液加入到第（2）步的混合液中充分混匀。

（4）第（3）步的混合液经针式滤器过滤（0.45 μm 水系滤膜，WG4614）即得到TRAP染色工作液。

注意：每片组织大约需要300-400 μL工作液，根据使用量配制，现配现用，避免浪费。

冰冻切片操作步骤（供参考）

1、切片处理：冰冻切片从-20℃冰箱取出，室温复温20 min后浸入纯水10 min待用。

2、试剂配制：在切片复温过程中，按以上方法配制ALP和TRAP染色工作液。[4℃保存的染液需提前30 min取出恢复至室温]

3、孵育ALP反应液：切片用组化笔（Y6111）画圈圈住组织后平放于透明湿盒内（湿盒底部加少量纯水保湿）。圈内滴加配制好的ALP染色工作液将组织均匀覆盖（孵育液不宜滴加太多否则液体溢出圈外）。盖好湿盒后于37℃恒温恒湿培养箱中孵育15~20 min。

4、清洗：倾去切片上的反应液后，用纯水清洗2-3次，每次5-10 s。

5、孵育TRAP反应液：在切片上滴加使用前刚配制好的TRAP染色工作液，37℃恒温恒湿培养箱孵育5~10 min。

6、清洗：倾去切片上的反应液后，用纯水清洗2-3次，每次5-10 s。

7、封片镜检：甘油明胶封片剂（Y1413）封片镜检。

染色结果

骨组织沿骨膜内整齐排列的矮柱状成骨细胞呈蓝色，软骨处和骨小梁边缘呈蓝色，破骨细胞呈酒红色或者浅红色。

注意事项

1．骨组织ALP+TRAP双重染色试剂盒A液不稳定，需要-20℃避光保存。使用时需现配现用，若未使用完，可-20℃保存，一周内有效。

2．配制骨组织ALP+TRAP工作液过程中出现乳状混浊是正常现象，配制完成后立即过滤溶液变清亮即可正常使用。

3．做ALP+TRAP双重染色的组织需要用中性通用型组织固定液（Y1112）4℃固定，固定一周内（24 h-48 h最佳）进行脱钙包埋冰冻切片染色。室温固定数小时就会影响酶活，4℃固定超过一周也会影响酶活，导致阳性减弱甚至丢失。

4．做ALP+TRAP双重染色的骨组织需要使用本试剂盒中的脱钙液或单独采购我司Y1116 EDTA脱钙液4 ℃低温脱钙（推荐使用我司YDH-10脱钙仪进行4℃低温脱钙）。其它脱钙液脱钙的组织，不保证染色结果。用酸性脱钙液脱钙的骨组织，酶失活阳性丢失。建议在我司进行骨组织的脱钙冰冻切片和染色全套实验服务。

5．在使用ALP+TRAP双重染色试剂盒时，要求先进行ALP染色，后进行TRAP染色；先进行TRAP染色会导致ALP无阳性。

6．ALP碱性磷酸酶染色生成的产物易溶于有机试剂，需使用水溶性甘油明胶封片剂（Y1413）封片。

参考图片

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）