HRP-AEC（红色）与HRP-DAB（棕色）双显色技术，双重免疫组化可避免因连续切片导致的组织区域错位，将定位精度提升至亚微米级（<1μm），可直接呈现两种蛋白在细胞或亚细胞水平的共表达、共定位关系；精准评估受体-配体结合、信号通路激活等分子互作事件，为病理机制研究提供可靠的空间生物学证据。适用于石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片、细胞涂片等组织样本的免疫组化双重染色，可用于不同来源抗体的双重荧光免疫标记，也适用于相同来源一抗的双重荧光免疫标记。

产品信息

产品简介

本产品免疫组化双重染色（Double Staining IHC）是在单张组织切片上通过二抗显色体系选用两种不同颜色的显色试剂同时检测显示两种蛋白。可在明场显微镜下直接呈现两种蛋白在组织微环境中的精确位置、邻近关系、浸润程度等，以分析两者间的相互关系。对珍贵或微量病理组织的研究具有显著优势，为病理诊断和科研提供了更加直观和详实的依据。

本试剂盒包含两种显色剂DAB（3,3'-二氨基联苯胺）和AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）都为HRP显色体系。需先标记一个抗体DAB显色后，进行抗体洗脱后再标记第二个抗体AEC显色。本试剂盒内免疫染色抗体洗脱液操作简单、条件温和、洗脱效果强劲，能在不损伤样本形态结构的基础上将一抗，二抗等彻底洗脱掉，可有效保证实验成功率。与HRP酶偶联物反应，DAB产生棕黄色沉淀，AEC产生红色沉淀，苏木素复染蓝色细胞核，三种颜色对比鲜明，易于观察。适用于石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片、细胞涂片等组织或细胞样本的免疫组化双重染色。

储存与运输

冰袋（wet ice）运输； 2-8℃保存，12个月有效期。

组成

实验前准备：

1. 自备抗原修复液（根据抗体及组织类型选择合适的抗原修复液，柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）（推荐Y1212，Y1213，Y1220等），Tris-EDTA抗原修复液（pH 8.0）（推荐Y1217，Y1218），Tris-EDTA抗原修复液（pH 9.0）（推荐Y1214，Y1229）；

2. 自备PBS磷酸盐缓冲液（推荐 Y4213 或 Y0013）；

3. 自备TBST缓冲液（推荐Y0015）;

4. 自备3% H2O2和0.3% H2O2；

5. 自备各种封闭用血清（根据抗体类型选择合适的封闭血清，推荐牛血清白蛋白 BSA YC305021或YC305017，正常驴血清Y1228，正常兔血清Y1220，正常山羊血清Y1219）；

6. 自备所需一抗；

7. 根据用量，按照下表比例配制显色工作液。

注：DAB显色工作液需现配现用，限当天使用，不建议长期保存。

AEC显色工作液必须现用现配，配制时依次加入C液、A液、B液，配好后避光保存，半小时内使用，未用完的剩余试剂废弃。

操作步骤

以石蜡组织切片为例，以下实验步骤中的实验用水均为纯水：

1. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液（Y1139）I 10 min-环保型脱蜡液（Y1139）II 10 min-环保型脱蜡液（Y1139）III 10 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-无水乙醇Ⅲ5 min-蒸馏水洗。

2. 抗原修复：根据组织类型及抗体种类，选择对应的抗原修复液(Y1230, pH 6.0；Y1218, pH 8.0；Y1229, pH 9.0)及修复方式进行抗原修复。一般修复方式为抗原修复仪（一科即将上市产品），微波，高压等高温修复。此过程中应防止修复液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（Y2167）中在钟摆摇床（YYC-Z100）上晃动洗涤3次，每次5 min。

3. 画圈,双氧水封闭：切片稍甩干后用组化笔（Y6111）沿着组织周围画圈，一般距离组织3 mm左右，画完圈待圈干后用纯水（Y4712）或PBS（Y2167）润洗一遍，之后将切片放入3%双氧水溶液中，室温避光孵育25 min，封闭内源性的过氧化物酶。封闭完成后将玻片置于PBS（Y2167）中在钟摆摇床（YYC-Z100）上晃动洗涤3次，每次5 min。

4. 血清封闭: 切片稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清室温封闭30 min，具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂。

5. 加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内（YIB-20F），4°C孵育过夜（湿盒底部加少量水防止抗体蒸发）。

6. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（Y2167）中在钟摆摇床（YYC-Z100）上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50 min。当一抗来源是兔和小鼠时，二抗可以直接滴加HRP标记多聚二抗（小鼠/兔通用）（Y1314），当一抗来源是兔和小鼠之外的种属时，需滴加对应种属HRP标记的二抗。

7. DAB显色：玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色工作液，显微镜下控制显色时间，直至显色至预期效果，自来水冲洗切片终止显色。

8. 抗体洗脱：切片稍甩干后将恢复至室温的免疫染色抗体洗脱液（Y1277）铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST（Y2161）中在钟摆摇床（YYC-Z100）上晃动洗涤3次，每次5 min。

9. 血清封闭: 切片稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清室温封闭30 min，具体根据第二种一抗及对应的二抗种属决定封闭试剂。

10. 加第二种一抗：在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内（YIB-20F）4°C孵育过夜。（湿盒底部加少量水防止抗体蒸发）。

11. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（Y2167）中在钟摆摇床（YYC-Z100）上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50 min。当一抗来源是兔和小鼠时，二抗可以直接滴加HRP标记多聚二抗（小鼠/兔通用）（Y1314），当一抗来源是兔和小鼠之外的种属时，需滴加对应种属HRP标记的二抗。

12. AEC显色：玻片置于TBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的AEC显色工作液，显微镜下控制显色时间，直至显色至预期效果，自来水冲洗切片终止显色。

13. 复染细胞核：苏木素（Y1015）复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液（Y1050）分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液（Y1051）返蓝，流水冲洗。

14. 封片：切片稍甩干后使用水性封片剂甘油明胶封片剂（Y1413）封片。

15. 镜检拍照：切片于显微镜下观察并采集图像，也可用扫描仪扫描成像。

注意事项

1. AEC显色工作液对光敏感，显色步骤需避光操作，封片后样本避光保存，1个月内完成数据采集。

2. 由于AEC显色试剂盒生成的产物为脂溶性沉淀，显色完成后的所有操作过程都不能经有机试剂如酒精，二甲苯等处理，否则易褪色导致实验失败。切片须用水性封片剂封片（推荐Y1413甘油明胶封片剂）。

3. 因AEC不耐受抗体洗脱液洗脱，只能做最后一个抗体的显色。

4. DAB对人体有害，操作时请小心，做好防护避免直接接触人体或吸入体内。

5. 严控显色时间，防止显色过度造成对结果定位的干扰。

6. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。

参考图片：

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！